乙型肝炎病毒（HBV）共价闭合环状DNA（cccDNA）是HBV复制的模板，在缺乏直接靶向cccDNA治疗药物的情况下，阻断cccDNA的补充并尽快耗竭已有的cccDNA是实现慢性乙型肝炎彻底治愈的关键。既往研究认为cccDNA的半衰期很长，但近期的一项研究结果提示cccDNA池的更新周期仅为数月，远低于之前的预测。未来，随着新的、能够完全抑制HBV复制的抗病毒药物出现，cccDNA池将有望因其补充被完全阻断而被彻底清除，进而实现慢性乙型肝炎的病毒学治愈。
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乙型肝炎病毒（HBV）感染是慢性乙型肝炎（CHB）、肝硬化和肝细胞癌（HCC）的主要病因。HBV转录复制的模板共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）以微小染色体（minichromosome）形式存在于感染肝细胞核内，其持续存在是HBV慢性感染、患者难以治愈和停药后复发的主要原因[1]。现有一线核苷（酸）类似物（NAs）能显著抑制病毒复制，加之口服方便，是目前治疗CHB患者的常用抗病毒药物之一。但由于该类药物缺乏直接靶向肝细胞核内cccDNA的作用，加之cccDNA非常稳定，停止或中断NAs治疗往往会导致HBV复制的重新激活甚至疾病复发，故患者不得不长期甚至终生服药[2]。
HBV感染肝细胞后，其3.2 kb长的松弛环状DNA（relaxed circular DNA，rcDNA）进入细胞核内并转换为cccDNA，并与组蛋白和乙型肝炎核心抗原（HBcAg，也称core蛋白）结合形成具有超螺旋结构的微染色体，成为病毒复制的模板。cccDNA可转录产生3.5 kb的前基因组RNA（pregenomic RNA，pgRNA），后者既可作为mRNA分别翻译合成病毒core蛋白和P蛋白，也可作为反转录的模板在P蛋白的作用下在核衣壳内合成rcDNA。带有rcDNA的核衣壳获得外包膜后释放入血生成子代病毒颗粒；部分rcDNA也可以重新脱掉衣壳入核，以补充并维持核内cccDNA池的相对稳定[3]。新近的一项研究[4]提示，在CHB患者cccDNA池的更新周期仅为数月，这一发现带来了通过耗竭cccDNA池实现对患者的病毒学治愈的希望。
包括我国《慢性乙型肝炎防治指南（2019版）》[5]在内的各大临床指南均推荐对有中度及以上肝损伤的CHB患者开展抗病毒治疗。这些活动性CHB患者因持续的肝脏炎症损伤，导致包括感染肝细胞在内的细胞不断死亡和代偿性增殖。而在增殖过程中，作为附加体（episomal）形式存在的cccDNA微染色体因缺乏染色体着丝粒结构，无法确保其进入子代肝细胞的胞核内。因此，cccDNA会随着细胞增殖被逐渐稀释、甚至完全丢失[6]。在这种情况下，新合成的rcDNA的补充对维持cccDNA池的相对稳定至关重要。
NAs是目前临床上最常用的抗HBV药物，其作用机制是竞争性抑制HBV P蛋白的反转录酶和DNA聚合酶的活性，显著抑制rcDNA的合成。理论上，在持续的NAs治疗下，cccDNA可能因补充途径被阻断而逐渐耗竭。荟萃分析[7]结果显示，部分接受长期NAs抗病毒治疗的CHB患者在停药后的确能够维持持续的病毒学应答。这一现象间接支持了长期治疗后存在cccDNA池耗竭的推测。
要想彻底治愈CHB，除了要完全抑制病毒复制和阻断cccDNA的补充外，还需清除已有的cccDNA。唯有如此，才有可能实现通过有限疗程在病毒学意义上治愈乙型肝炎。目前比较明确的是，NAs可以有效抑制病毒复制并在一定程度上影响cccDNA池的补充。因此，在不靶向cccDNA的情况下，耗竭cccDNA池所需的时间就成为了CHB在病毒学意义上能否被治愈的关键。
一项对鸭乙型肝炎病毒（DHBV）的研究[8]提示能否耗竭cccDNA池的关键在于cccDNA半衰期的长短。过去认为，cccDNA的半衰期很长，彻底清除cccDNA可能需要14.5年，因而CHB的治愈是场"持久战"[9]。Ko等[10]基于HepG2-NTCP-K7细胞培养模型的研究认为，cccDNA半衰期约为40 d。土拨鼠肝炎病毒（WHV）的cccDNA半衰期仅约为33~50 d[11]；在用NAs治疗阻止cccDNA池更新的情况下，鸭肝脏中DHBV cccDNA的半衰期可能仅为35~57 d[12]。此外，一项基于黑猩猩急性感染模型的研究[13]估算，HBV的cccDNA半衰期可能为9~14 d；而另一项研究[14]则发现，在细胞因子阻止黑猩猩肝细胞内cccDNA池的补充后，推算HBV cccDNA分子的半衰期仅为3 d。不同实验所推算的cccDNA半衰期存在显著差别的原因可能是，在细胞培养系统中研究cccDNA的半衰期，通常会受到培养细胞增殖、死亡的干扰；而不同药物对cccDNA补充的阻断效率上的差异也会影响cccDNA半衰期的测定。除此之外，不同的检测方法也会影响对cccDNA半衰期的测定，如Ko等[10]基于HepG2-NTCP-K7细胞培养模型的研究中，采用Southern印迹法确定的cccDNA半衰期约为40 d，而通过qPCR法测定的cccDNA半衰期则超过了40 d。这些基于细胞和动物实验的数据是否能够反映CHB患者的真实情况需要审慎对待。
近期Hepatology杂志在线发表了我国有关NAs治疗下cccDNA半衰期的研究[5]，该研究创新性地以抗病毒治疗过程中血清HBV pgRNA拉米夫定（LAM）耐药突变LAM（rtM204V）株的动态变化来反映cccDNA池的更新速度，并计算出cccDNA半衰期为6个月左右。这一发现为通过耗竭cccDNA池实现CHB治愈的可行性提供了强有力的证据。
由于cccDNA的动态检测需要连续进行肝活检，因此长期跟踪NAs治疗对cccDNA影响的研究较少。一项研究[15]证明，NAs治疗1年可将cccDNA数量从基线的每个细胞7.28拷贝降低至0.57拷贝（减少90.77%）。另一项研究[16]发现，相对于基线水平，恩替卡韦（ETV）治疗48周可使cccDNA降低0.9 log10拷贝/HGEq（human genome equivalent，HGEq）、LAM治疗则降低0.7 log10拷贝/HGEq，可见ETV能比LAM更有效地降低肝组织cccDNA和总HBV DNA水平，是更加强效地阻断rcDNA合成有助于使cccDNA池更快地减少。此外，我们实验室的研究[17]发现，NAs治疗下的子代病毒核酸主要是仅含有部分5’端序列的负链DNA以及3’末端被降解后残存的pgRNA，这些基因组不完整的子代DNA病毒和RNA病毒样颗粒缺乏感染性[18]。上述发现提示我们，NAs治疗不仅抑制了rcDNA的合成，同时也使子代病毒缺乏感染性，长期巩固治疗将有利于cccDNA的耗竭。然而，近期的一些研究[19,20]发现，约20%的经ETV治疗的CHB患者，其血清HBV DNA水平持续或间歇高于检测下限（20 IU/ml）但低于2 000 IU/ml。这种"低病毒血症"（low-level viremia，LLV）现象说明，现有的NAs治疗尚不能完全阻断病毒复制，也无法完全阻断cccDNA的补充。因此，现行指南中选择有明显肝损伤的患者开展抗病毒治疗，其背后的机制或许就是通过与细胞代偿性增殖和调节免疫系统联合，以通过清除感染肝细胞和残余感染肝细胞的增殖加速cccDNA池的丢失与稀释，有利于在有限时间的巩固治疗后耗竭cccDNA池[21]。
既往基于土拨鼠原代肝细胞体外感染模型发现，cccDNA在NAs作用下非常稳定。据此认为，cccDNA的消除取决于感染细胞的死亡而非分裂细胞内cccDNA的丢失，提示感染肝细胞的清除在HBV感染控制中具有重要作用[22,23]。随后有研究[7]发现，由于缺乏着丝粒，存在于细胞核内的cccDNA在肝细胞发生有丝分裂时很难均等地分布到子代细胞的胞核内，进入细胞质的cccDNA可能被核酸酶降解，进而造成新生肝细胞内cccDNA的稀释和丢失。既往郭巨涛等[24]的研究也已发现，新生肝细胞对HBV再感染有一定的抵抗。我们近期的一项研究[25]提示，在处于增殖状态的肝细胞中，HBV的功能性受体——牛磺胆酸钠共转运受体（NTCP）表达水平降低，且在肝细胞膜上的分布减少，可能是新生肝细胞抵抗HBV感染的重要机制。总之，在临床治疗中，除了需要清除感染肝细胞内的cccDNA外，还要防止已清除cccDNA的肝细胞再次感染，同时也要对难以分裂的感染肝细胞进行有效的识别清除。未来，NAs药物或靶向核衣壳的药物或许可以与HBV进入抑制剂如Myrcludex-B等联合使用，一方面抑制rcDNA的合成和cccDNA的补充，另一方面也可以阻止HBV进入肝细胞，进而有助于cccDNA的清除。
最新的《慢性乙型肝炎防治指南（2019年版）》[6]进一步强调了"临床治愈"（或功能性治愈）的概念，其主要特征为停药后乙型肝炎表面抗原（HBsAg）持续阴性（伴或不伴抗-HBs的出现）。遗憾的是，尽管长期的巩固治疗能将相当一部分患者的血清HBsAg维持在较低水平，但只有少数患者发生HBsAg阴转。有研究[26]表明，HBV感染肝细胞后与宿主基因组发生较高频率的基因整合，且HBV整合片段的断点多在DR2-DR1区域[27]，故整合的HBV病毒基因片段大多保留了编码HBsAg的基因的完整性，可继续表达HBsAg。与之一致，多项研究结果均表明，特别是在长期NAs治疗的乙型肝炎e抗原（HBeAg）阴性的患者中，整合的HBV DNA也是CHB患者HBsAg的来源之一[28]。这种状态下，血清HBsAg持续存在并不一定代表cccDNA的活跃转录。肝细胞核内的cccDNA是血清HBV pgRNA的唯一来源，血清HBV pgRNA可反映cccDNA的转录活性[29]。综上所述，在接受巩固治疗的患者，其血清HBV pgRNA在判定cccDNA转录活性方面明显优于HBV DNA和HBsAg。
一直以来，cccDNA的检测面临着诸多困难，如较低的cccDNA拷贝数、Southern blot操作的复杂性、rcDNA与cccDNA难以区分等问题，以及最重要的，肝活检的有创性使之不适用于多次动态检测。考虑到rcDNA完全来源于有转录活性的cccDNA、二者的存在均代表着肝内cccDNA的存在，我们认为，在对接受抗病毒治疗的患者检测其肝组织cccDNA是否耗竭时，没有必要排除rcDNA对cccDNA检测的干扰，而是可以将rcDNA和cccDNA统一定义为有感染潜能的HBV DNA。为此，我们建立了基于单一或双跨缺口PCR引物的特异性扩增rcDNA和cccDNA的方法[30]。
由于cccDNA是病毒复制的唯一模板，其清除将意味着病毒再无激活复制的可能性。据此，我们建议以"病毒学治愈"（virologic cure）来对"准临床治愈"的概念进行更新[31,32]。"病毒学治愈"特指停止NAs治疗后，CHB患者血清HBsAg仍可为低值阳性，但肝内cccDNA被清除或转录静默，表现为血清HBeAg、HBV DNA、HBV pgRNA和乙型肝炎病毒核心相关抗原（hepatitis B core-related antigen，HBcrAg）均持续阴性。"病毒学治愈"的患者HBV再激活的风险显著降低。但需要强调的是，病毒学治愈只是CHB患者抗病毒治疗下达到的一种状态，而非治疗的终点。对于优势人群应继续追求血清HBsAg阴转及临床治愈，以清除含有整合HBV DNA片段肝细胞表达的HBsAg，进一步降低HCC发生风险。
近年来，靶向清除cccDNA的研究已成为CHB抗病毒治疗的热点问题，如靶向清除cccDNA的细胞因子治疗、基因编辑技术等，以及靶向表观遗传学修饰静默cccDNA、靶向病毒蛋白负性调控cccDNA等[33]，但这些技术距离临床应用尚有较远的距离。
在当前缺乏直接靶向cccDNA药物的情况下，彻底清除感染肝细胞中的cccDNA需要克服两个关键的障碍。首先，需要完全阻断病毒复制和cccDNA池的补充；其次，必须在一个合理的时间内耗尽先前cccDNA池的库存。Huang等[5]报道的仅为数月的cccDNA池更新周期，为通过耗竭cccDNA治愈乙型肝炎带来了希望。未来多靶点、多层次的联合治疗可能完全抑制病毒复制和cccDNA补充以更快速而彻底地清除cccDNA，同时联合免疫调节治疗，使慢性乙型肝炎治愈成为可能。
所有作者均声明不存在利益冲突
