章思语; 阮晶晶; 金冬梅; 陈诺; 谢卫国; 阮琼芳

doi:10.3760/cma.j.cn501225-20230421-00137

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• 论著·瘢痕诊断与治疗 •

泛素特异性蛋白酶7基因的泛癌分析及其在瘢痕溃疡癌变中的表达

中华烧伤与创面修复杂志, 2023,39(6) : 518-526. DOI: 10.3760/cma.j.cn501225-20230421-00137

摘要

目的

探讨泛素特异性蛋白酶7（USP7）在瘢痕溃疡癌变过程中的生物学作用及其临床意义。

方法

采用回顾性观察性研究结合生物信息学分析方法。从癌症基因组图谱（TCGA）数据库和基因表达综合数据库中获取USP7在肿瘤和/或其对应癌旁正常组织中的RNA表达谱数据，并将RNA测序数据进行log₂转化。通过多维度癌症基因集cBioPortal数据库分析USP7基因变异情况，并分析其突变位点。通过TIMER 2.0数据库中“差异表达”模块获得TCGA数据库中肿瘤、癌旁正常组织USP7 mRNA表达情况。使用基因表达谱交互分析2（GEPIA2）数据库分析皮肤黑色素瘤（SKCM）、宫颈鳞状细胞癌（CESC）、肺鳞状细胞癌（LUSC）和头颈鳞状细胞癌（HNSC）中高表达USP7患者与低表达USP7患者的生存率并绘制Kaplan-Meier生存曲线。利用Sangerbox数据库分析USP7在泛癌中的表达与微卫星不稳定性（MSI）或肿瘤突变负担（TMB）的相关性。通过GEPIA2数据库中“相关性分析”模块，评估USP7在泛癌中的表达与5种DNA错配修复基因（MLH1、MSH2、MSH6、PMS2和EPCAM）表达水平和3种必需DNA甲基转移酶（DNMT）——DNMT1、DNMT3A、DNMT3B表达水平的相关性。通过TIMER 2.0数据库中“免疫-基因”模块分析USP7在CESC、HNSC、LUSC和SKCM中表达及其与免疫细胞（B细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞）浸润的相关性。利用GEPIA2数据库的“相似基因检测”模块获得与USP7表达模式相似且排名前100的蛋白集。将前述蛋白集与利用STRING数据库获得的与USP7有直接物理结合作用且排名前50的蛋白集进行交集分析。通过DAVID数据库对上述2个蛋白集进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）和基因本体论（GO）富集分析。收集2018年10月—2022年10月武汉大学附属同仁医院暨武汉市第三医院病理科有相应临床病理特征的正常皮肤、增生性瘢痕、瘢痕溃疡、瘢痕癌的术后标本，采用免疫组织化学法检测组织中USP7表达情况，样本数为6。对数据行Log-rank检验、单因素方差分析及Bonferroni检验。

结果

在泛癌中，USP7的主要基因变异类型为突变和扩增，变异频率（>6%）居前3位的肿瘤依次为膀胱尿路上皮癌、SKCM和子宫内膜癌。USP7基因在泛癌中的主要突变为错义突变。在突变频率最高的SKCM中，主要突变类型是USP7_ICP0_bdg结构域的错义突变。USP7 mRNA在乳腺浸润癌、胆管癌、结肠癌、食管癌、HNSC、肾嫌色细胞癌、肝细胞肝癌、肺腺癌、LUSC、前列腺癌和胃癌肿瘤组织中的表达均明显高于其对应的癌旁正常组织（P<0.05），在多形成性胶质细胞瘤、肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌和甲状腺癌中的表达均明显低于其对应的癌旁正常组织（P<0.05）；此外，USP7 mRNA在SKCM转移组织中的表达远高于其原发肿瘤组织（P<0.05）。生存曲线显示，在CESC、HNSC、LUSC和SKCM中，高表达USP7患者与低表达USP7患者的存活率比较，差异均无统计学意义（Log-rank P>0.05，风险比分别为1.00、0.99、1.00、1.30）。USP7在结肠癌、结直肠癌、胸腺癌、甲状腺癌中的表达均与TMB呈显著负相关（Pearson相关系数分别为-0.26、-0.19、-0.19和-0.11，P<0.05）；USP7在神经胶质瘤、CESC、肺腺癌、混合肾癌、LUSC中的表达均与MSI呈显著正相关（Pearson相关系数分别为0.22、0.14、0.15、0.08和0.14，P<0.05），在结肠癌、结直肠癌、乳腺浸润癌、前列腺癌、HNSC、甲状腺癌和弥漫性大B细胞淋巴瘤中的表达均与MSI呈显著负相关（Pearson相关系数分别为-0.31、-0.27、-0.13、-0.19、-0.16、-0.18和-0.53，P<0.05）。USP7在CESC中的表达与MSH2和MSH6的表达均呈明显正相关（Spearman相关系数分别为0.51和0.44，P<0.05），在HNSC中的表达与EPCAM、MLH1、MSH2、MSH6、PMS2的表达均呈明显正相关（Spearman相关系数分别为0.39、0.14、0.49、0.54和0.41，P<0.05），在LUSC中的表达与EPCAM、MSH2、MSH6和PMS2的表达均呈明显正相关（Spearman相关系数分别为0.20、0.36、0.40和0.34，P<0.05），在SKCM中的表达与EPCAM、MLH1、MSH2、MSH6和PMS2的表达均呈明显正相关（Spearman相关系数分别为0.11、0.33、0.42、0.55和0.34，P<0.05）；USP7在CESC、HNSC、LUSC和SKCM中的表达与DNMT1、DNMT3A和DNMT3B的表达均呈显著正相关（Spearman相关系数分别为0.42、0.34和0.22，0.45、0.52和0.22，0.36、0.36和0.22，0.38、0.46和0.21，P<0.05）。USP7在CESC、HNSC、LUSC和SKCM中的表达仅与CD4⁺T细胞浸润呈显著正相关（Partial相关系数分别为0.14、0.22、0.13、0.16，P<0.05）。与USP7表达模式相似且排名前100的蛋白集中，排名前5的蛋白依次是C16orf72、BCLAF1、UBN、GSPT1、ERI2（Spearman相关系数分别为0.83、0.74、0.73、0.73和0.72，P值均<0.05）。与USP7有直接物理结合作用且排名前50的蛋白集与前述蛋白集的交集仅有1个蛋白，即为甲状腺激素受体相互作用因子12。KEGG富集分析显示，USP7相关基因涉及细胞周期、剪接体、细胞衰老和p53信号通路等。GO富集分析显示，USP7相关基因涉及转录调控、蛋白质泛素化、DNA修复和细胞质模式识别受体信号通路等。临床样本分析显示，USP7在增生性瘢痕（0.35±0.05）、瘢痕溃疡（0.43±0.04）和瘢痕癌（0.61±0.03）中的表达均明显高于正常皮肤（0.18±0.04），P<0.05。

结论

USP7可能为临床瘢痕溃疡癌变恶化的生物标志物。

引用本文: 章思语, 阮晶晶, 金冬梅, 等. 泛素特异性蛋白酶7基因的泛癌分析及其在瘢痕溃疡癌变中的表达 [J] . 中华烧伤与创面修复杂志, 2023, 39(6) : 518-526. DOI: 10.3760/cma.j.cn501225-20230421-00137.

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本文亮点：

(1)对泛素特异性蛋白酶7（USP7）基因进行泛癌分析，全面阐述USP7在部分肿瘤发生发展中的作用机制。

(2)通过对临床样本的分析，验证了USP7在瘢痕溃疡癌变组织中的表达高于正常组织。

(3)提出USP7有望成为瘢痕溃疡癌变恶化的生物标志物，为临床诊疗提供帮助。

烧伤后浅表性瘢痕、增生性瘢痕、凹陷性瘢痕、萎缩性瘢痕等所在部位常因皮肤破裂被反复感染而形成溃疡^［1］。瘢痕局部的血液和氧气供应不足均会导致慢性炎症，随时间延长最终导致皮肤组织发生癌变。瘢痕癌（又称Marjolin溃疡）是一种罕见的侵袭性皮肤癌，发生在瘢痕组织、慢性溃疡和受炎症影响的皮肤区域^［2］。

蛋白质稳态失衡在创面愈合的发生发展中起重要作用，泛素-蛋白酶体通路的异常是其中的一个重要因素^［3］。在维持蛋白质稳态过程中，去泛素化酶对去除蛋白底物的泛素链至关重要，其异常活化或过表达均可导致创面不愈、溃疡发生和癌变恶化^{［4, 5］}。泛素特异性蛋白酶7（ubiquitin-specific protease 7，USP7）是目前研究广泛、成熟的去泛素化酶之一^［6］。许多蛋白已被鉴定为USP7的潜在底物和结合元件，如p53、小鼠双微体2（MDM2）、人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物（PTEN）、叉头样转录因子O4、β-联蛋白、核因子κB、Notch1^［7］，它们涉及的细胞衰老、血管生成、氧化应激和炎症环境等信号通路恰恰又与创面愈合密切相关^{［8, 9, 10, 11, 12, 13, 14］}。但目前，关于USP7与皮肤瘢痕继发溃疡、恶化和癌变关系的研究鲜见。

泛癌分析旨在研究不同类型肿瘤之间基因组和细胞改变的共性和差异，可辅助探索从一种类型肿瘤到另一种类型肿瘤的治疗方法^{［15, 16］}。本研究中，利用多种数据库，阐明USP7在泛癌中的生物学意义，并进一步揭示USP7在瘢痕癌相关恶性肿瘤，如皮肤黑色素瘤（SKCM）、宫颈鳞状细胞癌（CESC）、肺鳞状细胞癌（LUSC）和头颈鳞状细胞癌（HNSC）等中的重要作用及其可能的调控机制。最后结合临床样本评估USP7在增生性瘢痕、瘢痕溃疡和瘢痕癌中的表达水平，探讨其是否可以作为瘢痕溃疡癌变的标志物。

1 资料与方法

1.1 数据来源及处理

从癌症基因组图谱（TCGA，https：//tcga-data.nci.nih.gov/）数据库和基因表达综合数据库（GEO，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中获取USP7在肿瘤和/或其对应癌旁正常组织中的RNA表达谱数据，并将RNA测序数据进行log₂转化。

1.2 基因变异分析

通过多维度癌症基因集cBioPortal数据库（http：//cbioportal.org）分析USP7基因变异情况，并分析其突变位点。

1.3 基因表达分析

通过TIMER 2.0数据库（http：//timer.cistrome.org/）中“差异表达”模块获得TCGA数据库中肿瘤、癌旁正常组织中USP7 mRNA表达的箱式图，并将USP7 mRNA在肿瘤与其对应癌旁正常组织，或肿瘤与癌转移组织中的表达进行比较。

1.4 预后分析

使用基因表达谱交互分析2（GEPIA2，http：//gepia2.cancer-pku.cn/#correlation）数据库分析SKCM、CESC、HNSC和LUSC中高表达USP7患者与低表达USP7患者的生存率。

1.5 肿瘤相关特征

利用Sangerbox数据库（http：//vip.sangerbox.com）分析USP7在泛癌中的表达与微卫星不稳定性（MSI）和肿瘤突变负担（TMB）的相关性。通过GEPIA2数据库中“相关性分析”模块评估USP7在泛癌中的表达与5种DNA错配修复基因（MLH1、MSH2、MSH6、PMS2和EPCAM）表达水平和3种必需DNA甲基转移酶（DNMT）——DNMT1、DNMT3A、DNMT3B表达水平的相关性。

1.6 免疫浸润相关性分析

通过TIMER 2.0数据库中“免疫-基因”模块分析USP7在CESC、HNSC、LUSC和SKCM中表达与免疫细胞（B细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞）浸润的相关性。

1.7 信号通路富集分析

利用GEPIA2数据库的“相似基因检测”模块获得与USP7表达模式相似且排名前100的蛋白集。将前述蛋白集与利用STRING数据库（https：//string-db.org/）获得的与USP7有直接物理结合作用且排名前50的蛋白集进行交集分析。通过DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）对上述2个蛋白集进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）和基因本体论（GO）富集分析。

1.8 临床标本评估

该部分研究经武汉大学附属同仁医院暨武汉市第三医院（以下简称本院）伦理委员会审批（批号：KY2023-027），符合《赫尔辛基宣言》的基本原则。收集2018年10月—2022年10月本院病理科有相应临床病理特征的急性创伤后正常皮肤（来源于年龄29~68岁患者，男5例、女1例）、增生性瘢痕（来源于年龄31~64岁患者，男3例、女3例）、瘢痕溃疡（来源于年龄31~72岁患者，男4例、女2例）、瘢痕癌（来源于年龄26~66岁患者，男1例、女5例）的术后弃用标本，患者术前均未行化学治疗或放射治疗。取前述皮肤组织的冷冻标本进行常规免疫组织化学染色，一抗为兔抗人USP7多克隆抗体（北京博奥森生物科技有限公司，稀释比为1∶1 000），二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体（武汉赛维尔生物科技有限公司，稀释比为1∶5 000），USP7阳性染色为淡黄色、棕黄色或棕褐色。将切片置于100倍DP80型倒置光学显微镜（日本Olympus公司）下，任意取5个视野拍照，统计结果采用ImageJ软件（美国国立卫生研究院）进行半定量分析，结果取平均值。样本数为6。

1.9 统计学处理

使用SPSS 22.0和GraphPad Prism 6统计软件进行数据分析。采用单因素Cox回归分析高表达USP7患者与高表达USP7患者的总生存期，根据USP7表达值的中位数，采用Kaplan-Meier法绘制各肿瘤患者的生存曲线，并进行Log-rank检验。USP7在临床样本组织中表达的吸光度值数据均符合正态分布，以 $\bar{x} \pm s$ 表示，不同类型样本间的总体比较采用单因素方差分析，两两比较采用Bonferroni检验并对P值进行校正。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 泛癌中USP7基因的遗传变异分析

在泛癌中，USP7的主要基因变异为突变（绿色）和扩增（红色），且USP7基因的变异频率随肿瘤类型而变化。变异频率（>6%）居前3位的肿瘤依次为膀胱尿路上皮癌、SKCM和子宫内膜癌。在TCGA数据库中USP7基因变异最多的类型为突变。见图1。进一步探索显示，USP7基因在泛癌中的主要突变为错义突变（第4位的谷氨酰胺突变为组氨酸）。在突变频率最高的SKCM中主要突变类型是USP7_ICP0_bdg结构域的错义突变（第634位精氨酸突变为谷氨酰胺或者终止密码子），该突变可导致翻译提前终止和多肽链不完整。

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图1

通过cBioPortal数据库得出的泛素特异性蛋白酶7在泛癌中的遗传变异类型及其频率

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注：横坐标从左到右的癌组织种类依次是膀胱尿路上皮癌、皮肤黑色素瘤、子宫内膜癌、子宫肉瘤、直肠腺癌、乳腺浸润癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、卵巢浆液性囊腺癌、宫颈鳞状细胞癌、胃癌、食管癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、头颈鳞状细胞癌、肾上腺皮质癌、肝细胞肝癌、肉瘤、前列腺癌、急性髓细胞样白血病、间皮瘤、多形成性胶质细胞瘤、肾乳头状细胞癌、脑低级别胶质瘤、胰腺癌和肾透明细胞癌

图1

通过cBioPortal数据库得出的泛素特异性蛋白酶7在泛癌中的遗传变异类型及其频率

2.2 泛癌中USP7 mRNA表达分析

USP7 mRNA在乳腺浸润癌、胆管癌、结肠癌、食管癌、HNSC、肾嫌色细胞癌、肝细胞肝癌、肺腺癌、LUSC、前列腺癌和胃癌组织中的表达均明显高于其对应的癌旁正常组织（P值分别为<0.001、<0.001、<0.001、0.001、<0.001、<0.001、<0.001、0.004、<0.001、0.006、<0.001），在多形成性胶质细胞瘤、肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌和甲状腺癌中的表达均明显低于其对应的癌旁正常组织（P值分别为<0.001、<0.001、0.006、<0.001）。此外，USP7 mRNA在SKCM转移组织中的表达远高于其原发肿瘤组织（P=0.009）。见图2。

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图2

癌症基因组图谱数据库中泛素特异性蛋白酶7（USP7）mRNA表达水平分析的箱式图

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注：TPM为样本中平均每一百万个转录本中对应特定基因或转录本的数量；横坐标上从左到右的数字依次代表肾上腺皮质癌、膀胱尿路上皮癌、乳腺浸润癌、乳腺浸润基底癌、人表皮生长因子受体阳性乳腺浸润癌、LumA乳腺浸润癌、LumB乳腺浸润癌、宫颈癌、胆管癌、结肠癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、食管癌、多形成性胶质细胞瘤、头颈鳞状细胞癌、人乳头瘤病毒阳性头颈鳞状细胞癌、人乳头瘤病毒阴性头颈鳞状细胞癌、肾嫌色细胞癌、肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌、急性髓细胞样白血病、脑低级别胶质瘤、肝细胞肝癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、间皮瘤、卵巢浆液性囊腺癌、胰腺癌、嗜铬细胞瘤、前列腺癌、直肠腺癌、肉瘤、皮肤黑色素瘤、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、胸腺癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、葡萄膜黑色素瘤；红色代表肿瘤组织，蓝色代表正常对照组织，紫色代表癌转移组织；有对应正常组织/癌转移组织对照的癌种类背景色为灰色；与正常组织/癌转移组织相比，^aP<0.05

图2

癌症基因组图谱数据库中泛素特异性蛋白酶7（USP7）mRNA表达水平分析的箱式图

2.3 USP7的预后分析

生存曲线显示，在CESC（样本数146）、HNSC（样本数259）、LUSC（样本数241）和SKCM（样本数229）中，高表达USP7患者与低表达USP7患者的存活率比较，差异均无统计学意义（Log-rank P>0.05）。见图3。

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图3

USP7与4种类型肿瘤患者预后的生存曲线。3A.宫颈鳞状细胞癌（样本数为146），Log-rank P=0.86，风险比为1.00；3B.头颈鳞状细胞癌（样本数为259），Log-rank P=0.96，风险比为0.99；3C.肺鳞状细胞癌（样本数为241），Log-rank P=0.96,风险比为1.00；3D.皮肤黑色素瘤（样本数为229），Log-rank P=0.06，风险比为1.30

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注：蓝色实线/虚线代表低表达泛素特异性蛋白酶7（USP7）患者，红色实线/虚线代表高表达USP7患者，其中实线为患者的中位数生存曲线，虚线为95%置信区间

图3

2.4 泛癌中USP7与肿瘤相关特征的分析

USP7在结肠癌、结直肠癌、胸腺癌、甲状腺癌中的表达均与TMB呈显著负相关（Pearson相关系数分别为-0.26、-0.19、-0.19、-0.11，P值分别为<0.001、<0.001、0.0389、0.0163），而在CESC、HNSC、LUSC和SKCM中的表达与TMB相关性，差异均无统计学意义（P>0.05）。USP7在神经胶质瘤、CESC、肺腺癌、混合肾癌、LUSC中的表达均与MSI呈显著正相关（Pearson相关系数分别为0.22、0.14、0.15、0.08、0.14，P值分别为<0.001、0.016、<0.001、0.039、0.002），在结肠癌、结直肠癌、乳腺浸润癌、前列腺癌、HNSC、甲状腺癌和弥漫性大B细胞淋巴瘤中的表达均与MSI呈显著负相关（Pearson相关系数分别为-0.31、-0.27、-0.13、-0.19、-0.16、-0.18、-0.53，P<0.001），但在SKCM中的表达与MSI相关性，差异无统计学意义（P>0.05）。

USP7在CESC中的表达与MSH2和MSH6的表达均呈明显正相关（Spearman相关系数分别为0.51、0.44，P<0.001），在HNSC中的表达与EPCAM、MLH1、MSH2、MSH6、PMS2的表达均呈明显正相关（Spearman相关系数分别为0.39、0.14、0.49、0.54、0.41，P值分别为<0.001、0.001、<0.001、<0.001、<0.001），在LUSC中的表达与EPCAM、MSH2、MSH6和PMS2的表达均呈明显正相关（Spearman相关系数分别为0.20、0.36、0.40、0.34，P<0.001），在SKCM中的表达与EPCAM、MLH1、MSH2、MSH6和PMS2的表达均呈明显正相关（Spearman相关系数分别为0.11、0.33、0.42、0.55、0.34，P值分别为0.021、<0.001、<0.001、<0.001、0.001）。USP7在CESC、HNSC、LUSC和SKCM中的表达与DNMT1、DNMT3A和DNMT3B的表达均呈明显正相关（Spearman相关系数分别为0.42、0.34和0.22，0.45、0.52和0.22，0.36、0.36和0.22，0.38、0.46和0.21，P<0.001）。见图4。

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图4

泛癌中泛素特异性蛋白酶7（USP7）表达与肿瘤相关性的热图分析。4A.USP7表达与DNA错配修复基因表达的相关性分析；4B.USP7表达与DNA甲基转移酶基因表达的相关性分析

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注：DNMT为DNA甲基转移酶；PMS2、MSH6、MSH2、MLH1和EPCAM指DNA错配修复基因对应的表达；图4A和图4B中横坐标上癌组织种类及排序相同，从左到右均依次为肾上腺皮质癌、膀胱尿路上皮癌、乳腺浸润癌、乳腺浸润基底癌、人表皮生长因子受体2阳性乳腺浸润癌、LumA乳腺浸润癌、LumB乳腺浸润癌、宫颈鳞状细胞癌、胆管癌、结肠癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、食管癌、多形成性胶质细胞瘤、头颈鳞状细胞癌、人乳头瘤病毒阳性头颈鳞状细胞癌、人乳头瘤病毒阴性头颈鳞状细胞癌、肾嫌色细胞癌、肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌、脑低级别胶质瘤、肝细胞肝癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、间皮瘤、卵巢浆液性囊腺癌、胰腺癌、嗜铬细胞瘤、前列腺癌、直肠腺癌、肉瘤、皮肤黑色素瘤、转移性皮肤黑色素瘤、皮肤黑色素瘤原位癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、胸腺癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、葡萄膜黑色素瘤

图4

2.5 USP7表达与免疫浸润相关性分析

USP7在CESC、HNSC、LUSC和SKCM中的表达仅与CD4⁺T细胞浸润呈显著正相关（Partial相关系数分别为0.14、0.22、0.13和0.16，P值分别为0.023、<0.001、0.004、<0.001）。

2.6 USP7相关信号通路富集分析

与USP7表达模式相似且排名前100的蛋白集中，排名前5的蛋白依次为C16orf72、BCLAF1、UBN、GSPT1、ERI2（Spearman相关系数分别为0.83、0.74、0.73、0.73、0.72，P值均<0.001）。与USP7有直接物理结合作用且排名前50的蛋白集与前述蛋白集的交集仅有1个蛋白——甲状腺激素受体相互作用因子12。KEGG通路富集分析显示，USP7相关基因涉及细胞周期、剪接体、细胞衰老和p53信号通路等。GO通路富集分析显示，USP7相关基因涉及转录调控、蛋白质泛素化、DNA修复和细胞质模式识别受体信号通路等。见图5。

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图5

泛癌中泛素特异性蛋白酶7相关信号通路的京都基因与基因组百科全书（KEGG）和基因本体论（GO）富集分析。5A.KEGG富集分析；5B.GO富集分析

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注：FOX为叉头样转录因子，AMPK为腺苷一磷酸活化蛋白激酶；图5B横坐标从左到右依次为生物过程：蛋白质去泛素化、RNA PolⅡ启动子转录的负调控、RNA PolⅡ启动子转录的正调控、转录偶联核苷酸切除修复、病毒过程、蛋白质泛素化、泛素依赖性蛋白质分解代谢过程、转录正调控DNA模板化、DNA修复、细胞质模式识别受体信号通路，细胞组分：核浆、核、核斑点、胞质、染色质、核体、PcG蛋白复合物、核糖核蛋白复合物、染色体、转录抑制因子复合物，分子功能：染色质绑定、核糖核酸绑定、DNA结合、蛋白结合、启动子特异性染色质结合、泛素蛋白转移酶活性、锌离子结合、p53绑定、金属离子结合、组蛋白绑定

图5

泛癌中泛素特异性蛋白酶7相关信号通路的京都基因与基因组百科全书（KEGG）和基因本体论（GO）富集分析。5A.KEGG富集分析；5B.GO富集分析

2.7 USP7在临床组织样本中的表达水平

与正常皮肤相比，USP7蛋白在增生性瘢痕中表达呈弱阳性，在瘢痕溃疡中表达较强，在瘢痕癌中的表达极强。USP7在正常皮肤、增生性瘢痕、瘢痕溃疡和瘢痕癌中表达的吸光度值分别为0.18±0.04、0.35±0.05、0.43±0.04、0.61±0.03，总体比较，差异有统计学意义（F=120.68，P<0.001）；USP7在增生性瘢痕、瘢痕溃疡和瘢痕癌中表达均明显高于正常皮肤（P<0.001）。见图6。

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图6

泛素特异性蛋白酶7（USP7）在临床组织样本中的表达情况辣根过氧化物酶×100。6A、6B、6C、6D.分别为正常皮肤、增生性瘢痕、瘢痕溃疡和瘢痕癌组织样本，USP7（阳性表达为淡黄色、棕黄色或棕褐色，即红色箭头所示）的表达呈依次增强趋势

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图6

3 讨论

瘢痕溃疡癌变及创面局部某些癌基因的异常表达均与基因突变有关，癌基因编码后的产物通过复杂交错的胞内信号通路影响细胞增殖、衰老、凋亡及与细胞癌变发生发展相关的生物学现象。目前已有大量的文献在研究瘢痕溃疡癌变的生物标志物，如研究证实p53、PTEN基因、磷脂酰肌醇3激酶、蛋白激酶B和TGF-β₁基因在瘢痕癌、鳞状细胞癌组织中的过度表达与慢性皮肤溃疡癌变和肿瘤微环境关系密切^{［17, 18, 19, 20］}。瘢痕溃疡发生癌变相关机制研究的最终目标是为临床上防治瘢痕癌变提供治疗靶点，因此通过进一步深入开展瘢痕溃疡及其癌变的分子机制研究，筛选出癌变的干预治疗靶点，在瘢痕溃疡癌变的防治方面具有非常重要的意义。

通过泛癌分析可以了解肿瘤间的异同，为预防和治疗肿瘤靶点的设计提供指导，有助于肿瘤的早期诊断和敏感生物标志物的识别。近年来，许多研究聚焦于单基因泛癌分析以揭示单基因与肿瘤发生发展相关的基因突变、RNA改变和驱动基因的关系^［15］。去泛素化酶主要在细胞周期、DNA损伤修复、胞内信号转导、基因表达和染色体分离等方面起作用，其中USP7被认为是一个有吸引力的潜在肿瘤治疗靶点，USP7不仅参与宿主与病毒相互作用、DNA损伤与修复、基因表达与蛋白功能调节、免疫等细胞过程^［7］，同时又参与多种肿瘤，包括食道癌、骨髓瘤和卵巢癌等的发展。在机制调控方面，USP7可调节多种与肿瘤相关基因的表达，例如，它可以通过去泛素化来维持MDM2蛋白水平，并随后促进p53的降解^［21］；还可以通过影响PTEN蛋白的活性迫使其进入细胞核，诱导癌细胞发生凋亡^［22］。有研究显示，USP7可通过调节多种癌症相关信号通路负向影响肿瘤的免疫应答^［6，23］。本研究结果表明，USP7表达与基因变异、患者预后、肿瘤免疫相关特征和肿瘤微环境中免疫细胞浸润均存在显著相关性。同时本研究挖掘了USP7及其相关蛋白涉及的信号通路，一定程度上阐明高表达USP7导致瘢痕溃疡癌变的生物学机制，这为减少瘢痕溃疡发生和促进创面愈合提供了新的研究方向和思路。

综上，本研究认为USP7可能是瘢痕溃疡癌变的潜在生物标志物。但本研究的不足之处在于该结论是基于生物信息学手段分析得到的，未来还有待进一步的实验研究及临床试验去证实。最后，期望本研究能为瘢痕溃疡癌变的临床诊断治疗及其基础研究提供帮助。

本文引用格式：

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Zhang SY,Ruan JJ,Jin DM,et al.Pan-cancer analysis of ubiquitin-specific protease 7 and its expression changes in the carcinogenesis of scar ulcer[J].Chin J Burns Wounds,2023,39(6):518-526.DOI: 10.3760/cma.j.cn501225-20230421-00137.

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所有作者均声明不存在利益冲突

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贡献者信息

章思语

武汉大学附属同仁医院暨武汉市第三医院烧伤研究所，武汉　430060

阮晶晶

武汉大学附属同仁医院暨武汉市第三医院烧伤研究所，武汉　430060

金冬梅

武汉大学附属同仁医院暨武汉市第三医院病理科，武汉　430060

陈诺

武汉大学附属同仁医院暨武汉市第三医院烧伤研究所，武汉　430060

谢卫国

武汉大学附属同仁医院暨武汉市第三医院烧伤研究所，武汉　430060

阮琼芳

武汉大学附属同仁医院暨武汉市第三医院烧伤研究所，武汉　430060

通信作者

阮琼芳

武汉大学附属同仁医院暨武汉市第三医院烧伤研究所，武汉　430060

Email：qf_ruan@126.com

关键词

皮肤肿瘤; 瘢痕; 泛素特异性蛋白酶7; 泛癌分析; 瘢痕溃疡; 瘢痕癌; 创面修复;

基金项目

湖北省自然科学基金（2021CFB532）

湖北省卫健委科研项目（WJ2021M260）

王正国创伤医学发展基金会生长因子复兴计划（SZYZ-TR-10）

作者声明

作者贡献声明

章思语：酝酿、设计和实施研究，采集、分析、解释数据，撰写文章；阮晶晶，金冬梅：采集、分析、解释数据，研究指导，对文章的知识性内容作批判性审阅；陈诺：采集数据，对文章的知识性内容作批判性审阅；谢卫国：分析、解释数据，对文章的知识性内容作批判性审阅；阮琼芳：对文章的知识性内容作批判性审阅，经费支持，研究指导

利益冲突

利益冲突：

所有作者均声明不存在利益冲突

历史

出版日期：2023-06-20

收稿日期：2023-04-21

Original Articles·Diagnosis and Treatment of Scar

Pan-cancer analysis of ubiquitin-specific protease 7 and its expression changes in the carcinogenesis of scar ulcer

Zhang Siyu, Ruan Jingjing, Jin Dongmei, Chen Nuo, Xie Weiguo, Ruan Qiongfang

Published 2023-06-20

Cite as Chin J Burns, 2023, 39(6): 518-526. DOI: 10.3760/cma.j.cn501225-20230421-00137

Abstract

Objective

To explore the biological role and clinical significance of ubiquitin-specific protease 7 (USP7) in the carcinogenesis of scar ulcer.

Methods

A retrospective observational study combined with bioinformatics analysis was used. The RNA expression profile data of USP7 in tumor and/or its corresponding paracancular normal tissue were obtained from The Cancer Genome Atlas (TCGA) database and the Gene Expression Omnibus database, and the RNA sequencing data were transformed by log₂. The variations of USP7 gene were analyzed by cBioPortal database. The USP7 mRNA expression in tumor and adjacent normal tissue in TCGA database were obtained by using the "Gene_DE" module in TIMER 2.0 database. The survival rates of patients with high and low USP7 expression in cutaneous melanoma (SKCM), cervical squamous cell carcinoma (CESC), lung squamous cell carcinoma (LUSC), and head and neck squamous cell carcinoma (HNSC) were analyzed using the Gene Expression Profile Interactive Analysis 2 (GEPIA2) database, and the Kaplan-Meier survival curves were drawn. Sangerbox database was used to analyze the correlation of USP7 expression in pan-cancer with microsatellite instability (MSI) or tumor mutation burden (TMB) pan-cancer. Through the "correlation analysis" module in the GEPIA2 database, the correlation of USP7 expression in pan-cancer with the expression levels of five DNA mismatch repair genes (MLH1, MSH2, MSH6, PMS2, and EPCAM) and three essential DNA methyltransferases (DNMT)--DNMT1, DNMT3A, and DNMT3B were evaluated. The USP7 expression in CESC, HNSC, LUSC, and SKCM and its correlation with infiltration of immune cells (B cells, CD4⁺ T cells, CD8⁺ T cells, neutrophils, macrophages, and dendritic cells) were analyzed by the "Immune-Gene" module in TIMER 2.0 database. The "Similar Genes Detection" module of GEPIA2 database was used to obtain the top 100 protein sets with similar expression patterns to USP7. Intersection analysis was performed between the aforementioned protein sets and the top 50 protein sets that were directly physically bound to USP7 obtained by using the STRING database. Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) and Gene Ontology (GO) enrichment analysis were performed for the two protein sets mentioned above using the DAVID database. The samples of normal skin, hypertrophic scar, scar ulcer, and scar carcinoma with corresponding clinicopathologic features were collected from the Department of Pathology of Tongren Hospital of Wuhan University & Wuhan Third Hospital from October 2018 to October 2022, and the USP7 expression in tissue was detected by immunohistochemical method, with the number of samples of 6. Data were statistically analyzed with Log-rank test, one-way analysis of variance, and Bonferroni test.

Results

In pan-cancer, the main gene variations of USP7 were mutation and amplification, and the top 3 tumors with the highest variation frequency (>6%) were bladder urothelial carcinoma, SKCM, and endometrial carcinoma. The main mutation of USP7 gene in pan-cancer was missense mutation. In SKCM with the highest mutation frequency, the main type of mutation was missense mutation in USP7_ICP0_bdg domain. USP7 mRNA expression in breast invasive carcinoma, bile duct carcinoma, colon carcinoma, esophageal carcinoma, HNSC, renal chromophobe cell carcinoma, hepatocellular carcinoma, lung adenocarcinoma, LUSC, prostate carcinoma, and gastric carcinoma was significantly higher than that in corresponding paracancer normal tissue (P<0.05). USP7 mRNA expression in glioblastoma multiforme, renal clear cell carcinoma, renal papillary cell carcinoma, and thyroid carcinoma was significantly lower than that in corresponding paracancular normal tissue (P<0.05). In addition, USP7 mRNA expression in SKCM metastases was much higher than that in primary tumor tissue (P<0.05). Survival curves showed no significant difference in survival rate between patients with high USP7 expression and patients with low USP7 expression in CESC, HNSC, LUSC, and SKCM (Log-rank P>0.05, with hazard ratios of 1.00, 0.99, 1.00, and 1.30, respectively). USP7 expression in colon cancer, colorectal cancer, thymic cancer, and thyroid cancer was negatively correlated with TMB (with Pearson correlation coefficients of -0.26, -0.19, -0.19, and 0.11, respectively, P<0.05). USP7 expression in glioma, CESC, lung adenocarcinoma, mixed renal carcinoma, and LUSC was positively correlated with MSI expression (with Pearson correlation coefficients of 0.22, 0.14, 0.15, 0.08, and 0.14, respectively, P<0.05), and USP7 expression in colon cancer, colorectal cancer, invasive breast cancer, prostate cancer, HNSC, thyroid cancer, and diffuse large B-cell lymphoma were significantly negatively correlated with MSI expression (with Pearson correlation coefficients of -0.31, -0.27, -0.13, -0.19, -0.16, -0.18, and -0.53, respectively, P<0.05). The expression of USP7 in CESC was positively correlated with that of both MSH2 and MSH6 (with Spearman correlation coefficients of 0.51 and 0.44, respectively, P<0.05), and the expression of USP7 in HNSC was positively correlated with the expression of EPCAM, MLH1, MSH2, MSH6, and PMS2 (with Spearman correlation coefficients of 0.39, 0.14, 0.49, 0.54, and 0.41, respectively, P<0.05), and the expression of USP7 in LUSC was positively correlated with the expression of EPCAM, MSH2, MSH6, and PMS2 (with Spearman correlation coefficients of 0.20, 0.36, 0.40, and 0.34, respectively, P<0.05), and the expression of USP7 in SKCM was positively correlated with the expression of EPCAM, MLH1, MSH2, MSH6, and PMS2 (with Spearman correlation coefficients of 0.11, 0.33, 0.42, 0.55, and 0.34, respectively, P<0.05). The expression of USP7 in CESC, HNSC, LUSC, and SKCM was significantly positively correlated with the expression of DNMT1, DNMT3A, and DNMT3B (with Spearman correlation coefficients of 0.42, 0.34, 0.22, 0.45, 0.52, 0.22, 0.36, 0.36, 0.22, 0.38, 0.46, and 0.21, respectively, P<0.05). The expression of USP7 in CESC, HNSC, LUSC, and SKCM was positively correlated with CD4⁺ T cell infiltration (with Partial correlation coefficients of 0.14, 0.22, 0.13, and 0.16, respectively, P<0.05). Being similar to the pattern of USP7 expression and ranked among top 100 protein sets, the top 5 proteins were C16orf72, BCLAF1, UBN, GSPT1, ERI2 (with Spearman correlation coefficients of 0.83, 0.74, 0.73, and 0.72, respectively, all P values<0.05). The top 50 protein sets that directly physically bind to USP7 overlapped with the aforementioned protein set by only one protein, thyroid hormone receptor interaction factor 12. KEGG enrichment analysis showed that USP7 related genes were involved in cell cycle, spliceosome, cell senescence, and p53 signal pathway. GO enrichment analysis showed that USP7 related genes were involved in transcriptional regulation, protein ubiquitination, DNA repair, and cytoplasmic pattern recognition receptor signal pathways. Analysis of clinical samples showed that USP7 expression was significantly higher in hypertrophic scars (0.35±0.05), scar ulcers (0.43±0.04), and scar cancers (0.61±0.03) than in normal skin (0.18±0.04), P<0.05.

Conclusions

USP7 may be a clinical biomarker for the progression of cicatricial ulcer cancer.

Key words:

Skin neoplasms; Cicatrix; Ubiquitin-specific protease 7; Pan-cancer analysis; Scar ulcer; Cicatricial carcinoma; Wound repair

Contributor Information

Zhang Siyu

Institute of Burns, Tongren Hospital of Wuhan University &