鉴定1例难治/复发急性B淋巴细胞白血病(acute B cell lymphoblastic leukemia, B-ALL)患者中具有病理意义的融合基因，并探讨其实验室及临床特点。
应用转录组测序分析可能存在的融合基因，并结合实验室检测和临床资料进行分析。
经鉴定患者携带TCF3 exon 17-ZNF384 exon 7型融合基因，对应的染色体易位为隐匿性，不易通过核型分析发现。肿瘤细胞伴髓系抗原CD13和CD33表达。患者虽经多种化疗方案和CD19、CD22为靶点的嵌合抗原受体T细胞免疫治疗，仍多次全面复发。患者最终通过异基因造血干细胞移植(allogenic hemopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)获得完全缓解，微小残留病检测持续阴性。
转录组测序可有效检测白血病中可能存在的具有重要临床意义的融合基因。TCF3-ZNF384阳性的B-ALL具有独特的实验室和临床特征，可能对化疗和免疫治疗反应不佳，更容易复发，及时行allo-HSCT治疗可帮助这部分患者获得长期无病生存。TCF3-ZNF384阳性的B-ALL在儿童患者中并不少见，但未被有效鉴定，应被重视和进一步研究。
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急性B淋巴细胞白血病(B cell acute lymphoblastic leukemia, B-ALL)是儿童中发生率较高的一种恶性肿瘤。BCR-ABL1、ETV6-RUNX1等36种在血液肿瘤中已得到较多研究的融合基因在儿童B-ALL中的总体阳性率约为31.40%，已成为疾病诊断、指导治疗和监测微小残留病(minimal residual disease，MRD)的重要分子指标[1]。近年来研究者发现相当比例的血液肿瘤患者携带种类繁多的其他融合基因，其中一部分融合基因发生率并不低，但因缺乏显著的染色体核型改变而未被鉴定和研究[2,3]。对这些融合基因的有效鉴定具有重要的临床意义。转录组基因测序的成熟和应用为鉴定少见和未知的融合转录本提供了有效的工具[2]。近年来通过转录组测序，发现ZNF384易位形成的融合基因(ZNF384 fusion genes，ZNF384-FGs)在儿童B-ALL中的阳性率可达4.1%，且以TCF3-ZNF384和EP300-ZNF384相对多见[4,5]。ZNF384基因位于12号染色体短臂近端粒区(12p13.31)，其易位常难以通过常规的核型分析发现[6,7]。因此，虽然ZNF384-FGs的发生率并不低，但长期以来缺乏关注和研究，相关的报道很少。我们通过转录组测序发现的1例TCF3-ZNF384阳性的儿童B-ALL患者，并对其实验室检查特征和临床治疗情况进行了分析。
河北燕达陆道培医院收治的1例难治/复发的儿童B-ALL患者。使用患者的骨髓和外周血样本进行研究分析。本研究经河北燕达陆道培医院伦理委员会批准(道培伦审批[2020]第6号)，患者监护人签署了样本和临床资料可用于科研分析的知情同意书。
从患者第二次复发时细胞形态分析的原始及幼稚淋巴细胞占54.5%的骨髓样本中提取有核细胞总RNA，用Dynabeads Oligo dT 25磁珠(美国ThermoFisher公司)纯化得到mRNA。用HiSeq 2500型高通量基因测序仪(美国Illumina公司)进行转录组测序，采用双端150 bp测序模式，所得总数据量9.0 G。结合使用Arriba8(https：//github.com/suhrig/arriba/)和STAR-Fusion分析可能存在的融合转录本序列[8]。
将骨髓样本中提取得到的总RNA反转录为cDNA，用PCR基因扩增和Sanger法测序验证转录组测序和生物信息分析得到的TCF3-ZNF384融合转录本。上游引物序列5′-AGGAGAAGGAGGACGAGGAG-3′，位于TCF3第17外显子(NM_003200.5)；下游引物序列5′-GTGCTGGGCCAGGTAGG-3′，位于ZNF384第7外显子(NM_001135734.2)。使用3500DXXL型基因测序仪(美国ThermoFisher公司)进行Sanger测序。
患者，男，16岁，2015年5月因发热、头晕伴乏力就诊于当地医院。血常规检查：白细胞31.6×109/L、血红蛋白79.0 g/L，血小板51.0×109/L；骨髓形态原始和幼稚淋巴细胞占有核细胞76.0%；流式检测71.2%的有核细胞为恶性幼稚B淋巴细胞伴髓系抗原CD13和CD33表达；染色体核型正常；融合基因和基因突变未查。患者临床诊断为B-ALL，予地塞米松减低肿瘤负荷后，用VDLP(长春地辛、柔红霉素、培门冬酶和强的松)方案诱导化疗。化疗后免疫分型检测肿瘤细胞占0.24%。后予多次CAM(环磷酰胺、阿糖胞苷和6-巯基嘌呤)、COP(环磷酰胺、长春新碱和强的松)、VP(长春新碱和强的松)等方案化疗，间断复查骨髓形态和免疫分型，患者获得血液学完全缓解(complete remission，CR)，但MRD持续未转阴。
患者于2018年1月复查时发现骨髓原始和幼稚淋巴细胞占有核细胞17.5%，2018年3月增加至89.6%，白血病全面复发。经用两轮IVP(异博定、长春新碱和强的松)方案化疗，患者再次获得CR，但MRD仍阳性。患者于2018年5月经氟达拉滨和环磷酰胺预处理后，给予靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell，CAR-T)免疫细胞治疗。细胞输注后MRD监测仍持续阳性，并呈增加趋势。
患者于2018年10月来我院就诊。入院时血常规：白细胞1.7×109/L、血红蛋白75.9 g/L，血小板18.6×109/L。骨髓形态：原始和幼稚淋巴细胞占99.0%(图1)。流式免疫分型：93.1%的有核细胞为恶性幼稚B淋巴细胞伴髓系抗原CD13和CD33表达。G显带染色体核型：46, XY, add (6) (q21) [9]/ 46, XY, add (6) (q21), add (19) (p13.3) [9]/40, XY, add (1) (q25)，-7，-10，-10，-17，-19，-20，-21, +mar [1]/46, XY [3](图2)。Ph-like B-ALL相关8基因(包括ABL1、ABL2、CRLF2、CSF1R、EPOR、JAK2、PDGFRB和PR2Y8)荧光原位杂交检测未见异常。血液肿瘤中常见的36种融合基因筛查阴性，58种血液肿瘤突变基因分析阴性。结合入院检查和患者病史，参考世界卫生组织2016版造血和淋巴组织肿瘤分类标准诊断为B-ALL(治疗后复发)[11]。
考虑患者肿瘤细胞仍表达CD19，入院后于2018年11月再次给予化疗联合CD19-CAR-T治疗。细胞输注后第45天骨髓形态原始和幼稚淋巴细胞占有核细胞4.5%，第60天复查增长为11.0%。因CD19-CAR-T治疗效果不佳，考虑到肿瘤细胞表达CD22，于2019年1月再行化疗联合CD22-CAR-T治疗。细胞输注后第30天复查骨髓原始和幼稚淋巴细胞占42.0%。患者再经VLP(长春新碱、L-门冬酰胺酶和强的松)方案化疗后获得CR，之后行人类白细胞抗原基因10/10全相合的非血缘异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation, allo-HSCT)治疗。患者于移植后+13天白细胞植活，+15天血小板植活。截至最后随访日期，患者移植后已持续规律复查1年，供体细胞嵌合率监测持续为完全供者嵌合状态，骨髓形态及MRD监测均未见异常。
生物信息分析显示患者转录组中有TCF3 exon17-ZNF384 exon7和TCF3 exon18-ZNF384 exon7融合转录本表达，并经PCR扩增和Sanger测序验证(图3、图4)。序列分析显示TCF3 exon17-ZNF384 exon7为框内融合序列，推测为功能性的融合序列；TCF3 exon18-ZNF384 exon7的ZNF384编码部分发生了框外移码改变，推测为因可变剪接产生的非功能性融合序列。TCF3 exon17-ZNF384 exon7融合转录本中的TCF3基因保留了完整的转录激活域(transcriptional activation domain, TAD)、核定位信号和亮氨酸拉链结构域，丢失了bHLH结构域；ZNF384的基因保留了全部8个锌指结构(图5)。
近年来通过转录组测序发现儿童B-ALL中ZNF384-FGs并不少见，发生率可达3.5%～9.2%。有学者建议可作为一组单独的B-ALL遗传学分型[4,5]。迄今已报道9种ZNF384的融合伙伴基因，多为转录调节因子或染色质修饰相关的基因，其中以TCF3和EP300最多见[4,5]。TCF3(19p13.3)和ZNF384(12p13.31)基因分别位于第19和12号染色体的短臂末端，对应的染色体易位呈隐匿性，不易通过染色体核型分析发现。
文献报道的TCF3-ZNF384融合转录本以TCF3 exon13-ZNF384 exon3型多见，其次为TCF3 exon17-ZNF384 exon7型[5]。本例患者为TCF3 exon17-ZNF384 exon7型框内融合转录本，同时也检测到TCF3 exon18-ZNF384 exon7型框外融合转录本。推测该患者TCF3的基因组断裂位点位于第18内含子，ZNF384的基因组断裂位点位于第6内含子，由于可变剪接机制产生了两个融合转录本。
TCF3基因编码一种bHLH型转录因子，在正常B细胞分化中起重要作用[12]。本例及文献[5,7]报道的TCF3-ZNF384融合转录本均缺失TCF3的bHLH结构域，可能是导致肿瘤细胞分化阻滞的重要分子机制之一。ZNF384基因编码一种有8个C2H2型锌指结构的转录因子蛋白，在多种血细胞中表达，但在造血干细胞中表达量较低[13]。在ZNF384-FGs阳性的B-ALL患者中，ZNF384可能因易位导致过表达和功能上调，继而通过活化JAK-STAT信号通路促进肿瘤细胞增殖[13]。因此，ZNF384-FGs阳性的肿瘤细胞可能因JAK-STAT信号通路的活化而具有更强的增殖活性，也可能对JAK-STAT通路的靶向抑制剂敏感。
ZNF384-FGs阳性的B-ALL具有独特的转录组基因表达谱，多伴髓系抗原CD13和/或CD33异常表达[5,7,13]。本例患者的肿瘤细胞也表达CD13和CD33。目前对ZNF384-FGs阳性的B-ALL尚缺乏系统的研究，有限的文献对这部分患者的预后报道也不一致。有文献报道这部分患者临床表现为标危[13,14,15]。但一项较多病例的研究显示这部分患者可能有更高的白细胞计数、更差的激素治疗反应，并且更易复发[5]。本例患者初诊时即对VDLP方案反应不佳，虽经多种化疗方案和多次CAR-T免疫细胞治疗，仍多次复发。这与文献报道的TCF3- ZNF384阳性的B-ALL化疗耐药且易复发一致。尽早进行allo-HSCT治疗可能是这类患者减少复发和获得更长期生存的更佳选择。JAK-STAT通路抑制剂是否对这部分患者的治疗有帮助值得进一步研究。ZNF384-FGs在儿童B-ALL中发生率并不低，并且有独特的生物学特征和临床治疗特点，但一直未被有效鉴定，应得到重视和进一步研究。
所有作者均声明不存在利益冲突
