分析一个中国人结节性硬化症家系的临床特征，并探讨其发病的分子机制。
收集先证者及其家系成员的临床资料，采用全外显子组测序技术对先证者外周血DNA的TSC1和TSC2基因变异进行鉴定。经生物信息学分析后，对发现的潜在致病变异采用Sanger测序法对父母进行验证。
先证者及其母亲均携带TSC2基因新的c.4183C>T(p.Q1395X)杂合变异，生物信息学分析提示该变异为潜在的致病变异。先证者母亲同样诊断为结节性硬化症，但症状轻于患者。另外4名未患病的家系成员未发现上述突变。
TSC2基因新的c.4183C>T(p.Q1395X)杂合变异可能是该家系的致病原因。上述发现扩大了TSC2基因的突变谱。先证者症状重于其母亲考虑与表型异质性有关。
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结节性硬化症(tuberous sclerosis complex, TSC)是由TSC1或TSC2基因变异所致的常染色体显性遗传性神经皮肤综合征[1,2,3]，其特点为可累及机体的多个器官和系统，散发病例占2/3，家族遗传占1/3。TSC的临床表型多样，累及皮肤时会产生颜面部神经纤维瘤、牛奶咖啡斑及色素脱失斑、鲨鱼革样改变，累及内脏时会导致心、肾、肝、脾等脏器形成错构瘤，累及脑部时可导致室管膜下结节或钙化灶，但以面部血管纤维瘤、智力下降、癫痫最为常见，称为TSC的典型三联症[4,5]。患者可因临床症状的多样性而就诊于不同的专科。为减少误诊或者漏诊，进行基因检查将有助于该病的诊断[1]。我们收集了一个结节性硬化家系，应用全外显子组测序结合生物信息学分析发现TSC2基因新的c.4183C>T(p.Q1395X)可能致病的杂合变异。
一个来自湖南省衡阳市患TSC家系(3代共6人，图1)。先证者(Ⅲ1)，男，17岁。8个月时出现发作性点头、双手上举，四肢抽搐，在外院明确诊断为"婴儿痉挛症、结节性硬化"。8岁时反复发作癫痫，影像学检查提示颅内多发性结节性改变，在外院癫痫外科行部分结节切除手术治疗。术后癫痫发作有所缓解，但智能差于同龄儿，长期服用德巴金与得理多抗癫痫、西罗莫司抑制结节生长。查体：颜面部多发皮脂腺瘤改变(图2A)。脑电图提示以右侧为主的全导联棘慢波发放(图3)。先证者父母系非近亲结婚。母亲(Ⅱ2)，3岁时有癫痫发作，5岁后未再发作。颜面及胸背部皮肤可见多发结节样凸起皮面，背部皮肤鲨革样斑(图2B)。患者现42岁，智力稍差，能够从事超市收银工作。先证者父亲、外祖父、外祖母及舅舅均无类似病史。
经先证者父母签署知情同意书后，抽取先证者及父母的外周血各3 mL于EDTA抗凝管中，采用德国Qiagen公司生产的试剂盒提取基因组DNA，用分光光度计检测DNA纯度和浓度，要求DNA样品的吸光度的比值A260/A280在1.8～2.0之间，DNA的浓度为50～100 ng/μL。本研究经我院医学伦理委员会批准(2018-09)，并遵循赫尔辛基宣言。
将先证者的DNA送至北京金准基因科技有限责任公司行全外显子测序检测，采用安捷伦外显子芯片捕获+高通量测序。首先将DNA打断并制备文库，然后通过芯片对目标基因编码区及临近剪接区的DNA进行捕获和富集，最后使用高通量测序平台进行变异检测。测序参数为目标区覆盖率为99.9%，目标区平均深度为128.16，目标区平均深度>20×比例为97.7%，测序深度76/95(0.56)。
将新发现的TSC2基因突变(转录本号NM_000548)比对正常人数据库(千人基因组，Exac数据库)，以及HGMD、结节性硬化症数据库(Tuberous Sclerosis Database)，运用Mutation Taster软件及美国医学遗传学与基因组学学会(American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG)指南解释序列变异的致病性[6]。
对候选基因位点在该家系中进行Sanger测序验证。采用Primer 5.0软件设计引物：TSC2-34F: GGCTCTGTGTTCCTCCCTG，TSC2-34R: GACTCCCTACCCACTGCAG。PCR反应体系为50 μL，95℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 60 s，共35个循环，72℃延伸10 min，4℃保存。PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，产物纯化后经3730测序列分析仪(美国ABI公司)直接测序。用Chromas2.0软件对基因测序序列进行比对分析。
先证者检出TSC2基因第34外显子存在一个无义突变(c.4183C>T/p.Q1395X)，亲代验证发现母亲存在相同的位点改变(图4)。
c.4183C>T/p.Q1395X突变为无义突变，导致了蛋白质表达的终止。千人基因组数据库和ExAC数据库中未收录该变异，在结节性硬化症和HGMD数据库里未发现相关报道。经MutationTaster软件预测为致病变异，在家系中突变与疾病共分离，该变异携带者及母亲的表型符合单基因遗传病。按照ACMG标准分析该突变有一个非常强的致病依据(无义突变)、至少两个中等致病的依据(HGP和EXAc皆未收录)、2个致病的支持依据(突变与疾病共分离、表型符合单基因遗传病)，综合分析该突变为新发的致病变异。
TSC的神经系统典型损害表现为癫痫发作、智力下降、头面部血管纤维瘤三联征，其致病基因主要为TSC1和TSC2，所编码的蛋白质分别为错构瘤蛋白(hamartin)和马铃薯球蛋白(tuberin)[7,8]，二者具有高度亲和性，在细胞质内形成异源二聚体。Dabora等[9]发现TSC2基因突变者的临床症状更严重，容易出现智力落后、难治性癫痫、面部血管纤维瘤及视网膜错构瘤等。也有研究表明[10,11]，TSC2突变患者大脑皮质结节更多且占大脑体积的比例更高，发生认知损害的概率更大，癫痫发作年龄较早，其中婴儿痉挛占38%，63%的癫痫发作发生在1岁以内。Babcock等[12]认为婴儿痉挛可作为TSC患者出现智力障碍的独立风险因素。
在本研究中，我们发现了TSC2基因c.4183C>T(p.Q1395X)杂合变异，在该家系中先证者母亲携带相同变异，且为结节性硬化、癫痫患者，而父亲表型正常且无相应位点的改变，存在突变与疾病共分离，提示患者的致病变异来源于其母亲。先证者及母亲均有面部血管纤维瘤、癫痫、智力下降等表现，但先证者发病较早，出生8个月即出现婴儿痉挛，发生顽固性癫痫经手术及药物治疗后症状有所缓解，至今仍未完全控制，而母亲的癫痫症状成年后已经消失。母亲存在相同的基因型，而症状较先证者减轻，其他修饰基因的存在或环境等因素可能导致了临床症状的差异，出现了表型的异质性。有研究指出在TSC患者中，出现同样的突变基因时，子代表现可能比上一代要更严重[13]，本家系发病符合此特点。
TSC2基因编码蛋白Tuberin包括7个功能结构区，从N端到C端依次为亮氨酸拉链区、CCD1、CCD2、TAD1、GAPD、TAD2、钙调蛋白结合区[14]。本研究中的TSC2基因c.4183C>T突变导致第1395位氨基酸谷氨酰胺处提前出现终止密码子，形成一个截短蛋白(p.Q1395X)，并且该突变恰位于TAD1与GAPD两功能区之间，终止于GAP功能域前，导致TSC2基因的关键功能域缺失，影响到Tuberin蛋白的完整性，从而使其功能丧失。该无义突变在HGP和EXAc皆无报道，存在突变与疾病共分离、表型符合单基因遗传病，综合分析为新发的致病性变异。
综上所述，TSC2基因c.4183C>T(p.Q1395X)杂合变异可能是该TSC家系致病的原因。基因突变导致疾病的发生机制非常复杂，进一步行突变蛋白细胞模型和动物模型的功能研究将有助于致病机制的阐明。本研究明确了患病家系的诊断，进一步扩大了TSC基因致病突变谱，也为后续基因突变的功能研究提供了线索。
所有作者均声明不存在利益冲突
