染色体微阵列分析(chromosome microarray analysis，CMA)是检测染色体异常和拷贝数变异(copy number variation，CNV)的首选方法。本文介绍了CMA转化为临床应用的技术验证过程、技术标准和指南的建立和更新、以及现行规范下的诊断效果，重点阐述通过对病例系列研究中系统证据回顾的总结，提出CMA临床应用的专家共识和实践资源，并建立和更新一系列相应的技术标准和指南。专家共识和临床实践均支持CMA作为发育及智力障碍、多发性先天缺陷和自闭症检测染色体异常和CNV的首选方法并提供了后续检测的建议，相应的技术标准和指南规范完善了产前及产后组成型CNV的检测并扩展到各类肿瘤获得型CNV的检测。CMA检测显著提高了基因组异常的检出率，但仍需克服自身技术的局限并应对其他新型技术的挑战。美国通过对专家共识、实践资源、标准和指南等文献的指导和管理，使CMA检测为患者及亲属提供了合理有效和安全的诊断服务，为相关遗传病的临床诊断和基础研究提供了可靠的依据，同时为新技术的临床转化提供了参考和借鉴。
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常规核型分析是从单个细胞和整个基因组水平检测染色体数量和结构异常的标准方法。将该技术应用于实体瘤样品的检测时经常遇到细胞培养失败，导致无法获得中期细胞进行核型分析的情况。1992年，Kallioniemi等[1]发明了无需细胞培养的比较基因组杂交(comparative genomic hybridization，CGH)，该技术将不同荧光标记的肿瘤和正常对照样本DNA等量混合后与中期细胞染色体进行杂交，通过比较肿瘤和正常对照荧光信号的相对剂量来检测拷贝数异常。1995年，Schena等[2]利用CGH技术结合微阵列基因探针定量检测多个基因的表达。从1998年到2001年，微阵列比较基因组杂交技术(Array CGH，aCGH)被成功应用于检测单条染色体或整个基因组的拷贝数异常[3,4]。其后由生物技术公司开发的高密度寡核苷酸aCGH或高通量单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)微阵列芯片以及相应的分析软件开始被用于分析正常基因组的多态性拷贝数变异(copy number variation，CNV)和疾病相关的致病性CNV[5,6,7,8]。aCGH和SNP芯片技术被统称为染色体微阵列分析(chromosome microarray analysis，CMA)。随着CMA技术被迅速应用于遗传病的临床诊断，美国医学遗传与基因组学学会(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)推出了专家共识(Expert Consensus)和实践资源(Practice Resources)等指导性文件，并逐步建立和修订了一系列的临床实验室标准和指南(Standards and Guidelines)。本文系统介绍了这些指导性文件和标准指南的建立和发展过程及其应用效果，其中的经验不仅将有助于国内同行规范和改进CMA检测，为患者及亲属提供合理有效和安全的诊断服务，而且可以为后续新技术的临床转化提供参考借鉴，并促进相关遗传病的临床和基础研究。
为确保检测的可靠性和准确性，细胞遗传和分子遗传实验室在引进CMA进行临床检测时，需要进行技术和临床验证。高通量高密度CMA的技术验证需要运用接收器运行曲线(receiver operation curve，ROC)的统计方法。ROC方法可以直接显示aCGH的敏感性(sensitivity)、特异性(specificity)和分析精度(resolution)，同时可以直观比较不同技术平台的优劣[9]。技术验证也包括对aCGH识别SNP准确度的检验，以及分析正常人纯合子区域(regions of homozygosity，ROH)的染色体分布[10]。在将aCGH应用于产前和肿瘤患者时，也需要针对相应的患者系列对照常规核型结果进行临床验证分析，并通过检索文献和数据库阐明致病性CNV的临床意义[11,12]。
在特定类型的病例系列，如儿童学习/智力发育迟缓[7,13]、特发性精神发育迟滞[14]、以及儿童自闭症中[15,16]，CMA检测染色体异常和致病性CNV的有效性也得到了验证。早期基于多中心合作的检测数据表明CMA在儿童发育迟缓、智力障碍和多发性先天性异常中的检测阳性率可达11%～ 14%[16]。这些病例系列和协作研究的结果证明CMA优于常规核型分析，从而为其转化为临床检测应用提供了循证依据。为了给患者提供合理、有效和安全的CMA检测[17]，ACMG组织了若干工作组总结了CMA应用中积累的证据来制定相应的专家共识和建议、实践资源以及实验室技术标准和指南。这些指导性文件和标准指南不仅有效地指导和管理了CMA的临床应用，而且促成了临床CNV数据库的建立，为诠释检出CNV的临床意义提供可靠的依据。
2007年，ACMG临床实验室质量保证委员会的一个工作组制定了CMA检测细胞遗传学异常的应用指南[18]，并不断更新CMA在临床应用的实践资源和标准指南。表1列出了已发表的1篇专家共识、1篇实践资源和8篇技术标准和指南[18,19,20,21,22,23,24,25,26,27]。这些指导性文件规范、延伸和完善了CMA的应用范围，提高了异常检出率，并提供了针对性的后续检测和技术改进建议。
CMA应用共识、实践资源、技术标准和指南简介
CMA应用共识、实践资源、技术标准和指南简介
| 发表年份 | 循证类别 | 题目 | 主要内容 |
|---|---|---|---|
| 2007年[18] | 标准和指南 | CMA用于分析组成型细胞遗传异常 | 详述CMA在临床应用中的技术验证，分析标准，数据解读和结果报告等细则 |
| 2010年[19] | 专家共识 | 共识声明：CMA是发育障碍或先天异常患者的首选临床诊断检测 | 系统文献回顾的证据支持将CMA作为发育和智力障碍及先天缺陷的首选检测方法并提出了具体的分析流程 |
| 2010年[20] | 实践指南 | 在医学遗传实践中应用CMA检测染色体异常的建议 | 支持CMA作为发育和智力障碍及先天缺陷和自闭症等的首选检测方法 |
| 2011年[21] | 标准和指南 | ACMG解释和报告产后组成型CNV的标准和指南 | 规范产后检出CNV的临床解释和报告标准，将CNV的评判分为致病，临床意义不明以及良性3类 |
| 2011年[22] | 技术标准 | ACMG关于检测产后组成型异常的微阵列芯片设计和性能要求的建议 | 推荐微阵列芯片设计，探针选择和基因覆盖的要求以及芯片制造性能指标的分析验证 |
| 2013年[23] | 标准和指南 | ACMG产前和产后CMA检测组成型异常的 标准和指南：2013年修订版 | 阐述CMA检测优势及局限性，不同平台的性能差异，技术验证，质量控制以及结果的解释和报告等 |
| 2013年[24] | 标准和指南 | ACMG标准和指南：CMA检测肿瘤性疾病 染色体异常 | 规范肿瘤患者中应用CMA检测的技术验证，质量控制和报告解读 |
| 2018年[25] | 实践资源 | ACMG临床实践资源：神经发育障碍和先 天异常CMA分析的后续检测的效果评估 | 评价CMA检测后后续检测平衡易位，嵌合体，ROH等的临床意义 |
| 2019年[26] | 技术标准 | ACMG和CGC联合声明：肿瘤获得性拷贝 数异常和拷贝中性杂合缺失解释和报告的技术标准 | 规范肿瘤患者中拷贝数异常解读和报告的专用名词，4级分类方法和肿瘤参考数据库 |
| 2019年[27] | 技术标准 | ACMG和ClinGen联合声明：组成型CNV 解释和报告的技术标准 | 制定基于证据的CNV定量评分系统，将CNV分为致病，可能致病，临床意义不明，良性，可能良性5类 |
CMA在先天性发育和智力障碍患者中的早期应用显示其优于常规的核型分析，并有逐渐替代后者的趋势[13,14,15,16]。然而，各实验室采用不同的芯片设计导致其覆盖的基因存在差异，而且采用不同的数据库也导致对结果的诠释存在差异，这些给临床医师和患者造成了困扰。为此，国际标准细胞基因组学协作组(International Standard Cytogenomic Consortium，ISCA)在2009年组织10位临床医师(包括遗传咨询师)和17位临床诊断实验室主任进行了系统的文献回顾来评估CMA检测先天性发育和智力障碍的临床价值[19]。文献回顾的检索词包括"CMA"、"染色体异常"、"发育和智力障碍"、"多发先天缺陷"以及"自闭症"等，检索时段从2003年至2009年4月。选择的论文必须清晰描述患者群体的特征、技术平台和对结果的解释，而单纯的技术验证和局限于特定病种的论文则被排除。专家组对33篇原创论文的21 698病例进行了系统的回顾，结果显示CMA的异常检出率为15% ～20%，优于常规核型分析约3%的检出率。专家组同时对用于临床检测的微阵列探针密度、分析精度(>400 kb)和疾病位点的覆盖也提出了具体的要求。对于CMA无法检出的平衡易位、低比例嵌合体和有染色体异常家族史和多次流产史的患者则建议进行染色体核型分析。专家共识推荐将CMA作为发育和智力障碍、多发先天缺陷和自闭症的首选基因组检测方法，并提出了详细的分析流程，同时建议在美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)建立CNV数据库[19]。2010年，ACMG专业指南委员会开始推荐将CMA用于检测染色体异常[20]。
2014年底，ACMG组织工作组对将CMA作为首选的基因组检测方法在神经发育障碍和多发性先天缺陷中的应用效果和问题进行了证据回顾[25]。工作组提出了两个关键问题：(1)什么样的基因组异常如平衡重组、嵌合体和单亲双体无法被CMA准确检出？这些异常在患者中的发生率各为多少？(2)这些不能被CMA检出、而需要其他方法检测的基因组异常是否会改变患者的临床管理？通过对相关的关键词进行文献检索，工作组从9841篇论文中选出了25篇，然后根据论文的研究方法和内容分为高、中、低和不充分4级来评估将论文结果作为循证依据的质量。工作组依据总结的证据提出了以下建议：(1)在CMA检测结果为阴性的患者中，估计0.78%～1.3%存在平衡重组(易位、反转、插入)，而嵌合体的比率尚不清楚，建议进一步进行核型和荧光原位杂交分析；(2)CMA检出的单个致病或可能致病的拷贝数增加提示在相应位置的串联重复或其他位置的不平衡插入，大约2%的缺失和重复是由于父母的平衡插入，建议对检出拷贝数重复的先证者和父母进行核型和荧光原位杂交分析以利于评估复发风险；(3)一项研究提示在CMA检出多个(≥2)CNVs时，88%的患者可能与复杂核型相关，建议后续进行核型和荧光原位杂交分析；(4)在CMA检出染色体大片段同源区域(regions of homozygosity，ROH)提示单亲双体，建议后续进行分子检测并结合临床表型来诊断表观印记障碍或印记综合征；(5)而ROH出现在多个染色体上时提示父母近亲结婚或同系亲缘(identical by decent，IBD)，建议后续进行测序检测常染色体隐形遗传疾病。这些建议有助于实验室和临床医师根据CMA检测结果对患者推荐后续检测以提高异常检出率[25]。
ACMG工作组2007年制定的CMA标准和指南侧重于检测组成型细胞遗传异常[18]，2011年，工作组对CMA的芯片设计和性能指标提出了具体的建议[22]。2013年的修订版更新扩展了CMA在产前和产后的应用[23]，修订版涵盖以下主要方面：(1)总体考虑(general considerations)；(2)方法验证(verification and validation)；(3)对照DNA组(reference DNA set)；(4)软件考虑(software consideration)；(5)质量控制(quality control)；(6)结果解释和报告(interpretation and reporting)；(7)能力测试(proficiency testing)；(8)实验室认证和人员资质(laboratory accreditation and personnel qualification)。总体考虑部分简要总结了CMA技术的优势和局限以及芯片平台的设计要求。方法验证部分则描述了用30例涵盖各类异常的病例来评估技术平台的精准度(accuracy)和应用两个异常病例进行多次重复来评估精确度(precision)。CMA平台的更新升级、送检样品的变化、不同的检测结果(例如CNV、ROH/单亲双体、嵌合体/体细胞克隆)等均需要进行方法验证。对照组DNA的选择要考虑DNA的质量和性别并经过质量验证。分析软件需对其参数设置和报告结果进行全面评估，同时对技术员的实际操作和分析流程进行检查。质量控制涉及患者样品、处理过程、仪器校验和维护、试剂和基因芯片等的监控，质量保证侧重实验室认证、人员资质、能力测试和周转时间等。报告结果要参考多态性和致病性CNV数据库以及文献证据解释检出CNV的致病性、良性和非确定性。能力测试特指参加美国病理学会(College of American Pathologists，CAP)的CMA专项测查。实验室认证和人员资质应遵守现行的临床实验室法规。
CMA在过去几年中也被逐渐应用于肿瘤疾病的检测并提高了对染色体异常克隆的检测精度，建立了某些病变与特定肿瘤分型、预后和治疗的相关性。2013年，ACMG的另一个工作组推出了CMA检测肿瘤疾病中染色体异常的技术标准和指南[24]，该指南对CMA技术对于肿瘤检测的优势、局限性、平台性能验证和报告解读进行了详细的阐述，同时对检测的肿瘤细胞克隆异质性和检测局限也进行了说明。
对CNV结果的解释和报告是整个CMA技术流程中最重要的部分，不仅需要专业知识经验的积累，还要倾注大量的时间和精力分析相关的数据库和文献资料。2011年，ACMG推出了解释和报告产后检出CNV的标准和指南[21]，提出了系统评估检出CNV临床意义的步骤，包括：(1)了解已知的微缺失/微重复综合征；(2)考虑CNV的片段大小；(3)考虑CNV中包含的基因，并基于数据库和文献评判其与表型的关系；(4)比较内外部多个数据库对CNV的解释；根据评估结果将CNV分为致病(pathogenic)、临床意义不明(uncertain clinical significance)和良性(benign)3类，此外对检出CNV临床意义的诠释和报告也提出了具体要求。
2019年，ACMG与临床基因组数据库(Clinical Genome Resource，ClinGen)的专家组更新了CNV结果解释和报告的技术标准[27]。提出了基于CNV半定量评判的标准流程，根据该流程对检出的CNV涉及的基因内容、功能、数量和相关病例报告等因素进行打分，证据越强评分越高，无证据或已有证据支持不致病者评为零分或负分。最终将所有得分累加，CNV得分≥0.99评判为致病；0.90～0.98评判为可能致病；-0.89～0.89评判为临床意义不明确(variant of uncertain significance，VOUS)；-0.90～-0.98评判为可能良性；≤-0.99评判为良性[26]。这个更新指南将CNV明确分为5类：致病、可能致病、可能良性、良性和临床意义不明。而对CNV的报告原则新旧两部指南并无明显的区别，报告内容中对产前、产后患者的组成型CNV的临床意义以及后续的家系分析有具体的要求。值得强调的是，ACMG对各个临床实验室是否报告良性或可能良性的CNV并无强制性要求，建议由各实验室自行决定[21,27]。
2019年，ACMG与癌症基因组学协作组(Cancer Genomics Consortium，CGC)合作发布了解释和报告肿瘤获得性拷贝数异常(copy number abnormalities，CNA)和拷贝中性杂合缺失(copy-neutral loss of heterozygosity，CN-LOH)的技术标准[26]。合作组基于文献数据和专家共识，提出了针对获得性CNV和拷贝中性杂合缺失的4级循证依据，从高到底依次为：(1)变异与肿瘤的诊断、预后和治疗有很强的临床相关性；(2)变异有一定的临床相关性；(3)检出的细胞克隆变异与肿瘤无相关性；(4)良性或可能良性变异。对各类肿瘤中的一级和二级变异列出了参考范例，并选列了与获得型CNA和CN-LOH解释相关的数据库，同时规范了肿瘤患者获得型CNA和CN-LOH的CMA报告内容，对检出疑似组成型变异如何报告也进行了说明。
为了更好地指导和管理CMA检测的临床应用，ACMG组织各个工作组针对CMA技术平台、检测流程、适用范围、结果解释和报告以及后续检测等关键问题进行了系统的文献回顾和证据总结，以提出专家共识和实践资源，并建立和更新了一系列相应的技术标准和指南。建立统一和权威的CMA标准和指南、明确CNV的分类标准、以及建立可靠的共享开放的CNV表型数据库，是CMA在组成型CNV检测方面成功应用的关键。在肿瘤的CMA检测、特别是恶性血液病和淋巴瘤的检测方面，尽管制定了标准，但缺乏可以有效参考的CNA和CN-LOH与肿瘤分型预后治疗相关性的数据库。这在一定程度上限制了CMA的应用。随着CMA检测应用的拓展，各个工作组和其他相关专科也协同参与了技术标准和指南的更新和修订，参与工作组的专家为5～32人，平均约10人，标准和指南的写作时间为1～4年，大约每4～6年就要根据应用的进展和文献证据修订CMA的检测标准和指南。ACMG相关委员会的协调和工作组专家系统的文献回顾和及时的效应评估，是建立和更新标准和指南的组织保证。
现有的指南对嵌合体和ROH的检测仍然缺乏病例系列研究的证据[25,28]。最新的研究结果显示，检出致病性CNV患者的父母可能是该CNV的低比例嵌合体。这就对嵌合体的临床检测提出了更高的精度要求[29]。CMA可能检出临床意义不明的CNV或偶然发现有临床意义的其他CNV(例如增加肿瘤风险的CNV)，如何向患者清晰解释检测的结果仍然存在挑战。在检测应用中遇到的难题和挑战也为有针对性的技术开发和特定病例系列的研究提供了课题。
自2010年CMA被推荐作为发育和智力障碍及先天缺陷的首选基因组检测方法以来[19]，多中心大样本数据显示，CMA在核型正常患者中致病性CNV的检出率为7.7%[30]。一项10年的回顾性分析显示CMA对于产前和产后患者致病性CNV的检出率存在显著差异，在儿科患者中达9.8%，而在产前仅为2.6%。上述结果提示有必要进一步改进流程和技术来提高产前CNV的检出率[31]。随着高通量二代测序技术在遗传检测的应用，在发育和智力障碍及先天缺陷患者中，全外显子组测序(whole exome sequencing，WES)对于致病性基因突变的检出率可达25%[32]。系统文献回顾也显示WES可以逐渐替代CMA作为首选的基因组检测方法[33]。同时低通量全基因组测序(whole genome sequencing，WGS)也开始被用于在产前和产后检测染色体异常和致病性CNV[34,35]。这些基于二代测序技术的应用无疑会在下一个10年中进一步改变临床遗传学检测。尽管未来测序技术将能够同时检测单碱基突变、CNV乃至于基因组的结构变化，但是对每一类遗传变化的解释仍将遵循已有的遗传学专业知识和不断积累的临床证据。在技术的进步和应用中积累新的知识，及时通过系统文献回顾来总结证据，建立和更新相应的专家共识、实践资源和标准指南将是实施合理有效和安全的遗传检测的重要基础。
本文简要介绍了CMA技术的发展、临床应用的验证和转化、技术标准和指南的建立和修订、检测应用的效果、存在的局限以及面临的挑战等，重点阐述了系统回顾病例系列的研究结果、总结可靠证据、建立和更新相应的专家共识、实践资源、技术标准和指南的过程。这些标准和指南规范扩展和完善了CMA的临床应用，促成了临床CNV数据库的建立，同时能够反馈临床问题，促进相关遗传病的临床和基础研究。
感谢徐湘民与龚瑶琴教授在本文写作过程中给予的指导和帮助
所有作者均声明不存在利益冲突
