观察苯丙氨酸对胚胎干细胞(ESC)向视网膜色素上皮(RPE)细胞定向分化诱导效率的影响。
H1人ESC(hESC)分为对照组和实验组，以mTeSR培养基常规培养。细胞克隆过度融合后对照组以撤除碱性成纤维细胞生长因子、含10% knockout血清替代物的培养基诱导hESC自主分化至第7周。实验组从第3周开始在诱导培养基中添加0.2 mmol/L苯丙氨酸培养至第7周。观察两组细胞形态学变化；实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测人类配对盒基因6(Pax6)、小眼球相关转录因子(MITF)、RPE65、酪氨酸酶(tyrosinase)、Wnt配体(Wnt3a)、淋巴样增强因子-1(Lef1)、转录因子7(Tcf7)基因mRNA的表达；蛋白免疫印迹法(Western blot)检测MITF、RPE65蛋白的表达；流式细胞技术(FCM)检测RPE65阳性细胞比例。Sprague Dawley大鼠12只，随机分为对照组和治疗组；单眼内路法视网膜下腔注射，对照组注射2 μl 1倍磷酸盐缓冲液，治疗组注射2 μl纯化的hESC-RPE。治疗后6周行视网膜电图(ERG)检查，观察暗适应3.0 a-b波振幅。
诱导分化第7周，实验组出现大量肉眼可见的色素团块，明显多于对照组。色素化区域内可见多边形蜂窝状排列的单层细胞，胞质充满色素颗粒。RT-PCR检测结果显示，实验组Pax6、MITF、RPE65、tyrosinase(t＝39.44、26.14、31.28、77.24)、Wnt3a、Lef1、Tcf7 (t＝46.11、27.69、17.42)mRNA表达量高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。Western blot检测结果显示，实验组MITF、RPE65蛋白表达量高于对照组。FCM检测结果显示，实验组、对照组RPE65阳性比例分为(18.91±1.76)%、(0.88±0.09)%；实验组RPE65阳性比较明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。ERG检查结果显示，治疗组大鼠暗适应3.0 a-b波振幅较对照组显著提高，差异有统计学意义(t＝7.543，P<0.01)。
苯丙氨酸显著提高hESC向RPE定向诱导效率。hESC诱导来源的RPE细胞视网膜下移植能改善视网膜变性模型动物视功能。
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视网膜色素上皮(RPE)细胞的丢失和功能障碍是导致老年性黄斑变性(AMD)、视网膜色素变性(RP)等视网膜变性性疾病的主要原因。目前尚无有效治疗方法，人胚胎干细胞(hESC)来源的RPE(hESC-RPE)移植被认为是可能的治疗方案[1]。目前获得hESC-RPE的主要方法有撤除碱性成纤维细胞因子(bFGF)自主分化、早期应用Wnt和Nodal抑制剂诱导分化、转化生长因子-β抑制剂诱导分化等[2,3,4]，但均存在分化效率低、成本高、诱导药物的安全性不确定等问题。苯丙氨酸(phenylalanine)可诱导酪氨酸酶高表达，调控色素细胞增生、分化与色素合成[5]。为此，我们在诱导分化培养中加入苯丙氨酸，通过检测早期RPE标志人类配对盒基因6(Pax6)、小眼球相关转录因子(MITF)和成熟RPE标志RPE65、酪氨酸酶(tyrosinase)[6]的表达情况，观察其对RPE诱导效率的影响；诱导纯化的RPE细胞移植到视网膜变性模型大鼠视网膜下腔，同时对其治疗效果进行了观察；现将结果报道如下。
