异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)为诸多血液系统疾病的重要治疗手段。受者接受allo-HSCT后，移植物排斥(GR)、原发疾病复发及移植物抗宿主病(GVHD)的发生影响allo-HSCT成功与否。动态监测供受者嵌合状态对于预测疾病转归、减少疾病复发具有重要意义。预处理方案、基础疾病、输入干细胞数量等多种因素均会影响受者嵌合状态的形成。不同形式的嵌合状态及其临床意义亦各不相同。笔者拟就上述几个方面对allo-HSCT后嵌合状态影响的研究进展进行综述。
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自从20世纪60年代骨髓移植(bone marrow transplantation，BMT)应用于临床以来，异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)已经越来越广泛地应用于血液系统疾病及其他恶性实体肿瘤等的治疗。受者接受移植后出现的移植物排斥(graft rejection，GR)、原发疾病复发及移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)均与供、受者造血与免疫系统的嵌合状态密切相关，因此动态监测供、受者细胞的嵌合状态，并据此尽早做出临床干预，对于减少GR与原发疾病复发、有效控制GVHD具有重要意义。
嵌合状态是指在受者接受allo-HSCT后，供者细胞植入受者体内，供、受者双方造血细胞达到共存的现象[1]。嵌合状态通常分为：①完全供者嵌合状态(full donor chimerism，FDC)，其指在allo-HSCT后的受者标本中，供者细胞占受者的骨髓或外周血细胞比例≥95%；②供受者混合嵌合状态(mixed chimerism，MC)，其指在allo-HSCT后的受者标本中能同时检测到供者与受者细胞成分且供者细胞比例<95%[2]。FDC常见于清髓性allo-HSCT后，MC则多出现于减低强度(reduced-intensity conditioning，RIC)预处理或去T淋巴细胞allo-HSCT后[3]。理论上经过清髓性预处理后，受者细胞会被永久性清除。但Mickelson等[4]研究结果显示，在清髓性预处理后4周甚至更长的时间，仍可检测到受者T淋巴细胞。
骨髓或外周血均可用于allo-HSCT后受者嵌合状态的分析。Qin等[5]对21例复发白血病患者接受allo-HSCT后骨髓及外周血的嵌合状态进行分析。该研究结果显示，采用骨髓标本的嵌合状态检测敏感性优于外周血标本，且差异有统计学意义(P＝0.001)，这可能与受者细胞较早出现在骨髓中相关。allo-HSCT后各系细胞并非同时达到FDC。Breuer等[6]研究结果显示，监测外周血的系列特异性嵌合状态比检测全血可提供的信息量更多，从而预测价值更大。
早期allo-HSCT后受者嵌合状态的检测方法主要为免疫生化分析，包括红细胞抗原(血型)、白细胞抗原系统、红细胞同工酶等。然而，上述嵌合状态检测方法耗时长，敏感性及特异性亦存在限制。近年，嵌合状态的检测方法发展迅速，用于临床检测的方法包括荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)技术，限制性长度片段的多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)检测，可变串联重复序列(variable numbers of tandem repeat，VNTR)检测，短串联重复序列(short tandem repeat，STR)检测，荧光标记短串联重复序列聚合酶链式反应(short tandem repeat-polymerase chain reaction，STR-PCR)检测，实时定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction，RQ-PCR)检测及单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)检测等。
FISH技术的优势在于其敏感性较高(<1%)，且快速、安全，可定量；缺点在于只能应用于异性别allo-HSCT后受者的嵌合状态监测，且不适于大量样本的处理。秦尤文等[7]研究结果表明，对异性别allo-HSCT后受者早期嵌合状态的监测，FISH的敏感性略高于STR-PCR。
20世纪80年代出现的RFLP检测技术因操作复杂、样本需要量大、敏感性差而在临床应用中受限。目前，常用半定量或定量方法检测供受者DNA上特异性VNTR与STR来进行allo-HSCT后受者嵌合状态的早期监测。VNTR与STR检测的敏感性(1%～5%)及特异性均较高，同时检测所需要的细胞量较少。VNTR为人类DNA含有可变数串联重复序列的多态性位点，由长度为8～50 bp的重复序列组成；STR则主要为长度为3～7 bp的重复序列，其可以显示出高度的杂合性、多态性及个体化[8]，较VNTR检测敏感性更高。VNTR与STR检测相对FISH技术的优势在于其可适用于几乎全部供、受者。
SNP是指发生在基因组的单个核苷酸的替代，数量巨大、多态性很高，能充分反映个体间的遗传差异。SNP检测灵敏度为0.01%～0.10%，高于STR-PCR检测[9]。
RQ-PCR检测所需细胞量较少，且检测敏感性高(0.01%～0.10%)，而且操作迅速，但前期筛选出可区别供、受者合适基因序列的过程比较复杂。Jacque等[10]应用基因插入/缺失多态性RQ-PCR检测分析85例急性白血病患者接受allo-HSCT后的嵌合状态，研究结果发现RQ-PCR用于检测MC具有较高的敏感性，而且阴性预测价值较好。
Allo-HSCT后受者嵌合状态呈动态变化过程，早期形成的FDC可能继续保持稳定的FDC，亦可能随受者细胞比例增多转变为MC；而在早期检测到的MC可能维持稳定的MC，或者因供者细胞增多而形成FDC，亦可能随着供者细胞逐渐减少而导致GR。影响allo-HSCT后受者嵌合状态的因素包括预处理方案、基础疾病、造血干细胞的来源及数量、供者来源等。
预处理方案的强度会影响供者细胞的植入。Hong等[11]纳入897例淋巴增殖性疾病患者对非清髓性预处理allo-HSCT后的嵌合状态进行比较研究，其中行allo-HSCT前382例患者接受氟达拉滨(fludarabine)＋全身照射(total body irradiation，TBI)预处理方案，515例患者仅接受氟达拉滨处理。该研究结果显示前者形成FDC的比例(82%)显著高于后者(64%)，且差异有统计学意义(P＝0.006)。但Mickelson等[4]回顾性分析了207例采用清髓性或非清髓性预处理allo-HSCT的患者，根据预处理方案不同将其分为清髓性预处理[马利兰(busulphan)]、清髓性预处理(TBI)及非清髓性预处理(氟达拉滨/TBI)3组，研究结果显示3组患者均迅速形成供者细胞占受者的骨髓或外周血细胞比例≥90%供者T淋巴细胞嵌合状态，而且3组形成≥90%供者T淋巴细胞嵌合状态的时间相比，差异无统计学意义(P>0.05)。嵌合状态可能与其他因素，如基础疾病、allo-HSCT前预处理方案及检测时间点不同相关。
对于再生障碍性贫血(aplastic anemia，AA)，维持稳定的MC即可取得与FDC相近的生存率，但受者细胞比例存在增高趋势的MC可能导致GR[12]。Mickelson等[4]研究结果显示，淋巴瘤患者与骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome，MDS)患者相比，更易形成供者细胞比例较高的供者细胞嵌合状态，且差异有统计学意义(P<0.05)。这与Baron等[13]研究结果相似。但Reshef等[14]对121例RIC allo-HSCT受者嵌合状态进行分析，研究结果显示allo-HSCT后30 d受者全血与T淋巴细胞嵌合率在髓细胞白血病、淋巴细胞白血病中相比，差异无统计学意义(P>0.05)。
Baron等[13]研究结果显示，行外周血干细胞移植(peripheral blood stem cell transplantation，PBSCT)后患者的供者T淋巴细胞嵌合比例高于接受BMT患者，且差异有统计学意义(P＝0.002)，这是由于PBSCT输入的造血干细胞及淋巴细胞数量更多，有利于供者细胞植入与供者细胞嵌合率的提高。脐血移植后植入状态时MC的发生率(100%，27/27)与BMT(67%，28/42)相比更高，这可能与前者移植物中T淋巴细胞含量较少、且T淋巴细胞处于早期阶段，清除受者残存T淋巴细胞的能力较弱相关[15]。
Stikvoort等[16]发现接受亲缘供者allo-HSCT患者比接受无关供者的患者更容易出现MC，且差异有统计学意义(P＝0.005)，可能与亲缘供者与受者人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)相合程度更高，且亲缘供者allo-HSCT预处理强度比无关供者allo-HSCT弱相关。但Baron等[13]研究结果显示，接受亲缘供者与无关供者PBSCT后，供者T淋巴细胞嵌合率相比，差异无统计学意义(P>0.05)。不同研究结果可能与上述2项研究中预处理强度、患者构成、样本量以及GVHD预防方案的差异等因素相关。
Allo-HSCT后受者嵌合状态的影响因素还包括监测的时间间隔、样本数量、检测方法的灵敏度等。Berglund等[17]研究结果显示，allo-HSCT前增加预处理强度可以削弱宿主抗移植物(host versus graft，HVG)反应，从而有利于供者细胞的植入。
目前，allo-HSCT后受者嵌合状态检测的临床意义尚存争议，这主要与不同研究中所采用预处理方案、移植物来源、嵌合率的测定时间不同等诸多因素相关。因此，仅检测allo-HSCT后单一时间点嵌合率的临床价值有限，动态监测嵌合状态的变化过程对GR、复发及GVHD更具有判断意义。
GR为导致allo-HSCT失败的重要原因之一。NMA allo-HSCT由于减低预处理强度，供者细胞植入水平减低，因此GR发生率较高。动态监测allo-HSCT后受者的嵌合状态可以预示早期GR。Breuer等[6]对比了192例儿童接受MA与RIC allo-HSCT的结果，研究结果显示T淋巴细胞受者嵌合率<50%与自然杀伤(natural killer，NK)细胞受者嵌合率≤90%为低危组，受者发生GR的比例较低；T淋巴细胞与NK细胞受者嵌合率>90%为高危组，其中90%的受者出现GR；T淋巴细胞受者嵌合率>50%与NK细胞受者嵌合率≤90%为中危组，及时进行干预治疗可以避免GR的发生，但NK细胞受者嵌合率较高者对供者淋巴输注(donor lymphocyte infusion，DLI)治疗反应欠佳。但Lisini等[15]对比了27例行亲缘供者脐血移植与79例行亲缘供者、无关供者BMT的β-地中海贫血患儿，研究结果显示脐血移植后患儿可维持长时间稳定的MC而不发生GR，并未发生allo-HSCT失败，该研究结果可能与基础疾病集预处理方案不同相关。因此，对于MC是否增加allo-HSCT后受者GR可能性尚需更进一步深入研究。
采用RIC预处理或去T淋巴细胞allo-HSCT受者的复发风险会增高，这与受者造血细胞未被完全清除或者由供者T淋巴细胞介导的移植物抗白血病效应(graft versus leukemia，GVL)减弱相关。对于MC是否与受者复发风险相关，目前尚存争议。在多数RIC allo-HSCT相关研究报道中，MC比FDC受者复发的风险更高[18]。Koreth等[19]分析688例髓细胞与淋巴细胞恶性血液病患者接受allo-HSCT后＋30 d与＋100 d供者细胞嵌合率与预后的关系。研究结果显示allo-HSCT后＋100 d供者细胞嵌合率<90%会增加复发率风险(HR＝2.54，P<0.000 1)，而且allo-HSCT后＋100 d比＋30 d的预测价值更大。但van Besien等[20]分析了120例接受以阿伦单抗为基础预处理allo-HSCT后受者T淋巴细胞的嵌合状态，分别在allo-HSCT后＋30 d、＋100 d、＋180 d及1年进行监测，研究结果发现受者稳定的MC并不预示复发率的增高，该报道中大部分患者为髓细胞恶性疾病，由此推测可能MC与复发风险的关系与基础疾病相关。Terwey等[21]回顾性分析了101例急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)患者接受清髓性allo-HSCT后的嵌合状态，分析结果显示FDC、稳定的MC及受者细胞数目下降的MC患者复发风险相似(17%，17%，14%)，但与前3者相比，受者细胞持续增多的MC患者复发风险(53%)增高，且差异有统计学意义(P＝0.001 6)，该研究结果证实allo-HSCT后受者嵌合状态动态监测的重要性。
Allo-HSCT后供、受者细胞嵌合状态的动态监测，能预测急性移植物抗宿主病(acute GVHD，aGVHD)的发生。由于慢性移植物抗宿主病(chronic GVHD，cGVHD)的病因复杂，影响因素较多，其与嵌合状态的关系仍存在争议。Nikolousis等[22]对133例以阿伦单抗为基础RIC预处理allo-HSCT后受者的嵌合状态进行研究，研究结果显示allo-HSCT后＋90 d与＋180 d T淋巴细胞的FDC分别与aGVHD与cGVHD的高发生率相关。El-Cheikh等[18]对115例RIC预处理allo-HSCT后受者＋120 d的嵌合状态进行研究，研究结果发现伴Ⅱ～Ⅳ度aGVHD患者均为FDC，其余均为MC。Perruche等[23]研究结果显示，供者B淋巴细胞嵌合状态可能与cGVHD发生相关。
诸多研究结果均表明不同细胞亚群嵌合水平会影响allo-HSCT后受者预后。通过分子生物学方法检测allo-HSCT后受者达到供者细胞占主导的嵌合状态的时间早于传统临床检测方法所能检测到的造血重建时间点，因此可以通过分子生物学方法监测allo-HSCT后受者的嵌合状态进行早期供者细胞植入水平判断。allo-HSCT后受者嵌合状态的动态监测可以发现，allo-HSCT后供者细胞在受者体内的植入逐步进行，而且不同细胞的植入情况各有差异，这可能与基础疾病、预处理方案等诸多因素影响相关。早期，Childs等[24]采用氟达拉滨(fludarabine)/环磷酰胺(cyclophosphamide)预处理方案进行NMA allo-HSCT，研究结果显示供者T淋巴细胞的植入以及达到FDC(中位时间为30 d)均早于髓系细胞，NK细胞则居中。但与上述研究结果相反，Baron等[13]研究结果显示，供者NK细胞allo-HSCT后14 d内植入比例最高(中位比例为79%)，T淋巴细胞居中(CD8＋T细胞中位比例为69.4%，CD4＋ T细胞中位比例为69.1%)，粒细胞比例较低(中位比例为12%)，但14 d后供者粒细胞比例迅速增高(中位比例为90%)，并超过T淋巴细胞比例，最终T淋巴细胞达到FDC时间点晚于粒细胞。后续国内外多项研究报道得出类似结论[25]。Moscardó等[26]研究结果显示，相比MC，供者T淋巴细胞FDC的建立为供者细胞稳定植入的重要标志。Reshef等[14]研究结果显示，T淋巴细胞嵌合率与受者复发率、无事件生存(event-free survival，EFS)率、总生存(overall survival，OS)率均相关，而且T淋巴细胞比全血细胞对于预后的预测更为灵敏。
预防性DLI可以阻止受者疾病复发。allo-HSCT后嵌合状态动态监测有助于决定何时以及是否应用DLI。allo-HSCT后受者细胞嵌合比例进行性增高或出现FDC向MC转化时均为应用DLI的治疗时机。Liga等[27]研究结果显示，受者细胞嵌合比例进行性增高时应用DLI组较未应用DLI组可以提高受者1年与2年OS率、EFS率。Rettinger等[28]则在MC出现时即对患者应用DLI治疗，治疗结果显示相比不接受DLI治疗患者的EFS率(0)相比，接受DLI治疗患者的EFS率(46%)获得显著提高，且差异有统计学意义(P＝0.000 9)。Horn等[29]亦将MC出现作为DLI治疗时机，而不是在证实受者嵌合比例进行性增高后再应用DLI治疗，因为后者可能延误干预治疗时机从而提高受者复发率。在接受DLI治疗后继续对受者进行嵌合状态检测，治疗有效的患者均出现供者细胞比例的回升，甚至由复发时的MC转变为FDC，从而可以避免对DLI治疗有效的患者过度治疗而造成严重GVHD与骨髓抑制等并发症[30]。对接受DLI治疗后供者细胞比例无明显增高，及DLI治疗无效的患者，可以于早期行第2次DLI治疗或选择其他免疫疗法。
随着HLA配型技术的提高、供者选择的多样化以及支持治疗的不断改善，allo-HSCT的应用更加广泛。嵌合状态与稳定的供者细胞植入、原发疾病复发、GVHD等有着密切关系，选择合适的检测方法与早期、动态监测供者嵌合状态可以指导临床早期干预治疗，提高allo-HSCT后受者生存率。
