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• 综述 •
脐带血中造血干/祖细胞的体外扩增研究与临床应用进展
国际输血及血液学杂志, 2016,39(1) : 75-80. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1673-419X.2016.01.014
摘要

脐带血因具有来源广泛、采集方便、免疫配型要求低、移植后移植物抗宿主病(GVHD)发生率低等优点，为造血干细胞(HSC)的重要来源之一，为需要接受异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)的患者提供1种可靠的HSC来源。然而，脐带血干细胞移植(UCBT)亦存在一定的缺陷，由于脐带血的体积小、细胞数量极有限，其所含的造血干/祖细胞(HS/PC)数量有限，往往不能满足高体重儿童及成年患者allo-HSCT的需要，从而限制了UCBT在临床上的广泛应用。HS/PC体外扩增方法为解决上述难题的关键，笔者拟就HS/PC体外扩增方法的相关研究与临床应用进展进行综述。

引用本文: 刘秉珊, 宋永平. 脐带血中造血干/祖细胞的体外扩增研究与临床应用进展 [J] . 国际输血及血液学杂志, 2016, 39(1) : 75-80. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1673-419X.2016.01.014.
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脐带血中含有丰富的造血干细胞(hematopoietic stem cell，HSC)，在异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)中发挥着重要作用[1]。自1988年首例脐带血造血干细胞移植(umbilical cord blood transplantation，UCBT)成功[2]以来，目前在世界范围内UCBT已超过3万例，储存的脐带血已超过60万份[3]。然而，UCBT应用于临床的最大局限为储存脐带血的造血干/祖细胞(hematopoietic stem/progenitor cell，HS/PC)数量过少，因此通常仅能应用用于体重在30 kg以下患儿的UCBT，并且脐带血HS/PC与骨髓或外周血来源的HS/PC相比，细胞分化程度更加原始，植入所需时间长，患者造血功能恢复及免疫重建缓慢，感染等并发症发生率高，患者移植相关死亡率(transplantation related mortality，TRM)高。为了解决上述临床问题，大量相关研究正在进行中，以寻找体外扩增脐带血HS/PC的方法。笔者重点回顾近年来脐带血HS/PC体外扩增方法的进展以及相关临床试验结果。

1　脐带血造血干/祖细胞体外扩增的培养体系

体外模拟骨髓造血微环境的脐带血HS/PC体外扩增方法始于1977年。Dexter等[4]研究结果显示，将骨髓基质细胞作为体外扩增HS/PC的营养物质来源，可实现脐带血HS/PC的长期体外培养。随后一系列体外扩增脐带血HS/PC共培养技术获得较大的进展，如与骨髓来源的基质细胞[5]，永生基质细胞[6]，内皮细胞[7]，以及骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)[8]共培养技术。上述研究结果均显示，①与骨髓基质细胞共培养通常可提高脐带血HS/PC的扩增效率，并延长脐带血HS/PC的扩增时间；②通过共培养技术扩增后的脐带血HS/PC可保持原有细胞表型不变；③外源性的细胞因子可协同骨髓基质细胞促进脐带血HS/PC扩增；④骨髓基质细胞可通过接触或非接触的方式调节脐带血HS/PC的扩增，这说明骨髓基质细胞对脐带血HS/PC的调节机制是多方面的；⑤相较于没有应用基质细胞的脐带血HS/PC扩增方法，应用骨髓基质细胞共培养技术通常可促进UCBT后脐带血HS/PC的植入；⑥相较于没有应用基质细胞的脐带血HS/PC扩增方法，应用骨髓基质细胞共培养技术可提高脐带血单个核细胞(mononucleated cell，MNC)中HS/PC的扩增效率；⑦骨髓基质细胞可分泌大量的细胞因子与趋化因子，这有利于提高脐带血HS/PC的扩增效率。Khoury等[9]报道了1种使体外培养8周的脐带血HS/PC数目扩增60倍的方法，即将脐带血HS/PC中CD34＋CD133＋细胞和经处理过的MSC共培养，该方法可长期维持HS/PC特性；UCBT及连续移植试验结果均显示该体外扩增方法所得脐带血HS/PC可达24周的高水平植入。

脐带血HS/PC扩增及分化均能够通过相关细胞因子进行调节。细胞因子在各种脐带血HS/PC体外扩增培养的方法中均发挥着不可或缺的作用，探索体外扩增脐带血HS/PC的细胞因子最优组合及最佳浓度为当前相关研究的热点。然而，大部分相关研究仅检测了脐带血HS/PC体外扩增培养后应用于UCBT的早期植入情况(植入时间<10周)，这时短期脐带血HS/PC比例仍占据植入细胞的主导地位[10]。尽管可通过连续移植试验对脐带血HS/PC的植入情况进行检测，但脐带血HS/PC的扩增水平通常被高估。多项研究结果均显示，干细胞因子(stem cell factor，SCF)，Fms样酪氨酸激酶3配体(Fms-like tyrosine kinase 3 ligand，FL)，白细胞介素(interleukin，IL)-3、-6及粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)对体外扩增HS/PC群中，长期培养启动细胞(long-term culture initiating cell，LTC-IC)具有支持作用[11,12]。后续研究结果证实，相关细胞因子"早期行为"的作用，即高浓度的SCF、FL联合血小板生成素(thrombopoietin，TPO)共同作用于HSC与巨核细胞，可刺激静止期HSC进入有丝分裂、进行自我更新，从而影响HS/PC的自我更新[11,12]。并且，细胞因子是以独立又协作的方式调节脐带血HS/PC的扩增与分化。Pineault等[13]采用SCF、FL、TPO及IL-6对脐带血HS/PC中CD34＋细胞进行扩增，研究结果显示CD34＋细胞扩增为上述各个细胞因子累积作用的结果，且SCF与FL、SCF与IL-6、FL与IL-6两两之间亦存在协同作用。Kobayashi等[14]研究结果显示，胰岛素样生长因子结合蛋白(insulin-like growth factor-binding protein，IGFBP)-2可协同血管生成素样蛋白(angiopoietin-like protein，ANGPTL)家族成员影响脐带血HS/PC的扩增，并促进其短期植入，但对于脐带血HS/PC的长期植入的促进作用相对较弱。其他具有类似作用的细胞因子包括：胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor，IGF)-1，胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor，IGF)-2，以及纤维原细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)-1等[15]。总之，SCF、TPO及FL均为影响脐带血HS/PC扩增的最主要细胞因子，并且其他生长因子可能增强其作用。然而，在存在上述细胞因子的体外扩增条件下，所得具有长期植入能力的脐带血HS/PC(>20周)是否获得显著扩增，仍需进一步深入研究予以验证。

2　脐带血造血干/祖细胞扩增的信号通路

近年，在寻找扩增脐带血HS/PC调控因子、相关信号通路甚至发挥调控作用的小分子物质方面，取得了较大的研究进展。基于基因参与造血调控过程的理论，目前，多数学者认为可能参与造血调控过程的基因包括Wnt、HOX基因家族，以及Notch信号通路，其中Notch配体Delta-1的相关研究成果最为突出。目前，已有4个Notch受体(Notch1～4)和5个配体(Delta-1、-3、-4及Jagged-1、-2)在哺乳动物中被发现，并且相应功能亦得到验证[16]。Benveniste等[17]研究结果显示，Notch信号通路在HSC的体外扩增及自我更新中格外重要，其可能在体内亦具有重要作用，从而影响脐带血HS/PC的扩增及自我更新。Notch配体，如Delta-1、-4在体内、外均可刺激静止期HSC进入细胞周期进行扩增。Delta1ext-IgG联合应用细胞外黏连蛋白及多种细胞因子，可促进脐带血HS/PC中CD34＋及CD34＋CD38－细胞的扩增[18,19]，有助于其短期植入，且该脐带血HS/PC体外扩增方法已经在临床试验中取得成功。此外，其他基因亦可能与HSC的扩增相关。Buske等[20]使用逆转录病毒或慢病毒载体持续表达目的基因，其中包括HOXB4基因；HOXB4基因可在体内、外促进小鼠HSC的自我更新，对人HSC的作用则相对较弱。融合蛋白反式激活因子(transactivator，TAT)-HOXB4，包含TAT，可作为生长因子加入到脐带血HS/PC体外扩增培养体系中，能够促进人与鼠脐带血HS/PC扩增[21]。但因为TAT-HOXB4的细胞寿命太短(约为1 h)、稳定性差(<4 h)，且生产过程复杂，所以短时间内很难用于临床。

3　小分子化合物扩增脐带血造血干/祖细胞

小分子化合物在脐带血HS/PC扩增体系中具有其独特优势，其具有价格便宜、获取简易、理化性质稳定、操作简单等优点。组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古霉素(trichostatin A，TSA)与DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine，5azaD)作为染色质修饰试剂，为首批被发现可减慢细胞周期进程、促进脐带血HS/PC扩增的小分子化合物[22]。尼克酰胺(nicotinamide，NIC)为维生素B3的酰胺衍生物，可通过调节去乙酰化酶sirtuin(SIRT)作用于脐带血HS/PC中CD34＋细胞，使其分化延迟，并促进其归巢、植入[23]。近期文献报道，赖氨酸甲基转移酶抑制剂UNC0638亦可维持脐带血HS/PC中CD34＋CD49f＋细胞与CD34＋CD38－CD45RA－细胞扩增，可提高其细胞数量至传统培养方式的2倍[24]。UNC0638协同嘌呤衍生物StemRegenin(SR)1可维持脐带血HS/PC的原始细胞特性，可使植入8周后脐带血HS/PC的数量提高至传统培养方式的5倍[24]。与染色质修饰试剂相似，铜离子螯合剂四乙烯五胺(tetraethylenepentamine，TEPA)可通过调节细胞内铜离子水平，调控脐带血HS/PC的自我更新及多向分化能力[25]。TEPA可以维持脐带血HS/PC中CD34＋CD38－细胞的长期增殖，提高CD34＋细胞的植入率[26]。SR1为有效扩增CD34＋CD133＋细胞的激动剂，其为对100 000种杂环化合物进行无偏倚筛选后得到的小分子化合物，可显著扩增脐带血HS/PC中CD34＋细胞，以及各系细胞集落形成单位(colony-forming unit，CFU)[27]。SR1的结构类似于嘌呤，可有效实现外周血和脐带血HS/PC中CD34＋细胞的显著扩增及CFU的增加。例如，SR1可维持CFU>1 000倍的扩增，使体外扩增培养16周的SRC数目增长17倍，并保持其多系细胞长期重建能力。Boitano等[27]研究结果显示，对于脐带血HS/PC中CD34＋细胞，SR1为有效的芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor，AHR)拮抗剂。Fares等[28]筛选超过5 200种小分子化合物后得到的1种迄今为止功能最强的CD34＋CD45RA－细胞扩增激动剂pyrimidoindole，命名为UM171。UM171与SR1相比，更能够促进植入后20周的脐带血HS/PC扩增；新鲜脐带血HS/PC使用UM171与SR1后可分别扩增至原有细胞数目的13倍、2倍。且UM171更有助于脐带血HS/PC植入后的长期扩增，而SR1对短期扩增的促进作用更大。进一步的研究结果亦证实，UM171在猴脐带血HS/PC中CD34＋细胞植入中发挥作用[28]。UM171对移植后脐带血HS/PC长期扩增的作用机制目前尚不清楚，但是相关基因转录组性能分析提示UM171未下调AHR信号通路，但其抑制红细胞与巨核细胞分化的相关基因[28]。

4　小分子化合物提高脐带血造血干/祖细胞的归巢效率

促进脐带血HS/PC归巢亦为解决造血恢复延迟问题的方法之一。多种天然或者合成的小分子化合物可以提高人脐带血HS/PC向骨髓归巢效率、提高脐带血HS/PC的植入水平。所促进脐带血HS/PC归巢的小分子化合物包括16，16-二甲基-前列腺素(16，16-dimethyl-prostaglandin，dmPG)E2[29]，抗菌阳离子肽LL-37[30]，二肽基肽酶4抑制剂西他列汀[31]，糖原合成酶激酶(glycogen synthase kinase，GSK)-3抑制剂CHIR-911[32]，组蛋白去乙酰化抑制剂丙戊酸[33]，黏多糖透明质酸[34]及补体分子C3a[35]等。这些小分子化合物的最大优势在于应用简单。部分选择素及其配体亦可促进脐带血HS/PC归巢，如P-选择素糖蛋白配体1等。Xia等[36]研究结果显示，由于脐带血HS/PC表面受体的岩藻糖基化水平减低，导致脐带血HS/PC对选择素的亲和力降低。使用岩藻糖转移酶处理脐带血HS/PC 0.5 h，即可提高脐带血HS/PC表面的岩藻糖化水平，增强其与骨髓微环境表达的选择素结合，可促进脐带血HS/PC归巢，从而加强非肥胖型糖尿病/严重联合免疫缺陷(non-obese diabetes/severe combined immunodeficient，NOD/SCID)小鼠动物模型中脐带血HS/PC的植入。获得美国食品监督管理局(Food and Drug Administration, FDA)批准的DPP4抑制剂西格列汀，作为糖尿病的治疗药物已在临床应用多年。Farag等[37]研究结果显示，患者行UCBT后接受DPP4抑制剂治疗3 d(d－1～d＋2)，患者耐受良好，脐带血HS/PC植入状况得到改善。Cutler等[38]进行经dmPGE2处理的双份UCBT临床试验，试验结果显示患者中性粒细胞植入时间提前，中位时间为17.5 d，接受未经dmPGE2处理的双份UCBT患者的中性粒细胞植入时间为21.0 d，二者相比，差异有统计学意义(P＝0.045)；12例行dmPGE2处理的双份UCBT的患者中10例获得长期植入。Popat等[39]进行1项双份UCBT的临床试验，其中1份脐带血在移植前经过岩藻糖转移酶处理，试验结果显示患者行双份UCBT后中性粒细胞植入的中位时间为17.0 d，血小板植入时间则为35.0 d。

5　脐带血造血干/祖细胞的体外扩增方法的临床应用

近十年，体外扩增脐带血HS/PC在短期植入研究领域已取得较好的结果。在此基础上，部分相关Ⅰ期与Ⅱ期临床试验已经陆续开展起来。首次临床使用细胞因子扩增后的单份脐带血行UCBT的试验，患者未发生明显不良反应，但其中性粒细胞恢复[绝对中性粒细胞计数(absolute neutrophil count，ANC)≥0.5×109/L]的中位时间与血小板计数恢复(≥20×109/L)的中位时间与普通UCBT相比未获得改善[40]。该试验的主要缺陷在于其仅扩增单份脐带血的其中一部分(40%～60%)。考虑到UCBT植入成功与否主要是依靠细胞数量[40]，因此单份UCBT试验很难取得突破性进展。然而，该临床试验及其他早期临床试验结果均证实UCBT的安全性[41]。

双份UCBT的临床应用为探索脐带血HS/PC体外扩增方法提供更好的发展机会。双份UCBT为同时移植2份脐带血HS/PC，1份是未处理的脐带血HS/PC，另1份是经扩增的脐带血HS/PC。在此条件下，经扩增处理的脐带血HS/PC数量可能非常多，由此可能对UCBT植入情况产生更大的影响。同时，未扩增的另1份脐带血可以保证安全的HS/PC来源，以保证脐带血HS/PC的长期植入。该脐带血HS/PC体外扩增方法于1999年首次应用于临床，并获得成功[42,43]。Fernandez等[43]的研究结果显示，扩增后的脐带血HS/PC可能有助于短期髓细胞生成。

尽管随后的UCBT临床试验未取得改善脐带血HS/PC植入状况的预期目的[44]。但是，Delaney等[45]报道的Notch信号通路为基础的脐带血HS/PC扩增方法为后续探索脐带血HS/PC体外扩增的相关研究清除了阻碍。使用以Notch信号通路为基础的脐带血HS/PC体外扩增的方法可实现脐带血HS/PC中CD34＋细胞获得164倍的扩增，脐带血HS/PC的髓系植入亦获得显著改善，患者中性粒细胞计数恢复至正常水平的中位时间仅为16 d(接受传统治疗患者的中性粒细胞计数恢复至正常水平的中位时间为26 d)。嵌合体分析结果显示，基于Notch信号通路扩增的脐带血HS/PC在很大程度上利于早期中性粒细胞的植入，其长期植入则几乎全部来自未扩增的脐带血[44]。随后研究结果显示，输注基于Notch信号通路扩增后冷冻保存的人类白细胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)不全相合脐带血HS/PC，仍可加速中性粒细胞的植入；但中性粒细胞计数恢复至正常水平的中位时间略微延迟(中位时间为19 d)，且来源于扩增脐带血的中性粒细胞仅在移植后2周，即减低至监测水平以下。尽管如此，输注基于Notch信号通路扩增后冷冻保存的脐带血HS/PC与传统治疗相比，仍可使患者脐带血HS/PC植入的中位时间提前(19 d与25 d)，并使得移植后第100天血小板计数恢复至正常水平的累积发生率提高(92%与69%)[46]。Summers等[47]研究结果显示，采用基于Notch信号通路扩增的脐带血HS/PC行UCBT的患者，其中性粒细胞数的提高与中性粒细胞数量减低持续时间的缩短，均与患者感染率减低相关。总之，上述研究结果证实基于Notch信号通路扩增脐带血HS/PC方法的优势。1项涉及6个研究中心、计划纳入160例患者的多中心随机临床试验正在进行中，用以确定采用基于Notch信号通路扩增的脐带血HS/PC进行UCBT的疗效。

最近，de Lima等[48]研究脐带血HS/PC与MSC共培养扩增方法的结果显示，该方法的优势在于不需要花费昂贵的费用进行脐带血HS/PC富集，并且亦因此避免了细胞损失。该研究将脐带血HS/PC在原代MSC或者中胚层细胞中扩增培养7 d，然后使用相关细胞因子再扩增培养7 d，最终实现脐带血HS/PC中CD34＋细胞数目中位值增长为原有细胞中位数目的30倍。该体外扩增培养所得脐带血HS/PC应用于双份UCBT，患者中性粒细胞植入时间<15 d；第26天中性粒细胞植入累积发生率为88%，传统体外扩增方式仅为53%～62%。并且，血小板植入时间亦获得提前，第60天血小板植入累积发生率为71%，传统体外扩增方式为31%～52%。约50%的患者在UCBT后3～4周呈现混合性嵌合状态，但长期植入(>12个月)的脐带血HS/PC主要来源于未扩增的那1份脐带血。

Horwitz等[49]采用NIC扩增21 d后的脐带血进行移植，其中，脐带血中未扩增培养的T淋巴细胞被冷冻保存，与NIC扩增后的脐带血HS/PC共同输注。该脐带血体外扩增方案可加速UCBT后中性粒细胞的植入；该研究纳入10例采用上述脐带血HS/PC体外扩增培养方案的UCBT患者，其中有8例实现来自NIC扩增脐带血的持久性髓系植入。大部分患者在UCBT后长达3年，仍可观察到持久的来自NIC扩增所得脐带血的髓系细胞及T淋巴细胞的植入。

Wagner等[50]研究结果显示，采用SR1方案对脐带血HS/PC进行15 d体外扩增培养后，可实现脐带血HS/PC中CD34＋细胞328.0倍扩增(65.9～844.0倍)，所得细胞数目的中位值为12.3×106/kg[(2.3～48.5)×106/kg]，并且输注后显著加速中性粒细胞的植入(中位时间为11 d)。上述脐带血HS/PC体外扩增培养方案应用于UCBT的Ⅱ期临床试验正在进行中。以上研究结果均证实脐带血HS/PC体外扩增培养方法可加速UCBT后患者造血功能恢复，这是UCBT得到临床广泛应用的关键。

6　结束语

近年，脐带血HS/PC体外扩增培养方案中的关键细胞因子、小分子化合物被陆续发现，其均可在体外稳定地促进脐带血HS/PC的扩增。有效的脐带血HS/PC体外扩增培养的转化平台可增高UCBT成功率，减低TRM率，改善UCBT后患者的预后和生活质量。多个独立的相关临床试验均取得较好结果，这证实可通过脐带血HS/PC体外扩增培养方法提高UCBT的疗效，且其有着良好的临床应用发展前景。

利益冲突
利益冲突

无

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脐血干细胞移植
造血干细胞
细胞培养技术
临床试验
异基因造血干细胞移植
Notch信号通路
移植物抗宿主病
CD34细胞
骨髓基质细胞
小分子化合物