循环游离DNA(cfDNA)在健康个体与肿瘤患者中均可以被检测到，而循环肿瘤DNA(ctDNA)通常仅能在肿瘤患者外周血中被检测到。近年对于淋巴瘤中ctDNA的相关研究结果亦证实，相较于目前用于诊断淋巴瘤的其他指标与检查手段，ctDNA具有灵敏度及特异度均较高，创伤小等优点。随着相关研究的深入，研究者发现ctDNA亦可用于检测淋巴瘤的微小残留病(MRD)。因此，ctDNA有望成为可预测、检测、监测淋巴瘤的新型分子标志物。
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循环游离DNA(cell-free DNA，cfDNA)为出现在肿瘤患者外周血循环中的DNA，在健康个体外周血中亦可以检测到少量cfDNA。目前认为，cfDNA有2种来源，一种是由正常细胞凋亡或分泌释放，另一种则来源于肿瘤细胞凋亡、坏死释放或存活肿瘤细胞分泌，而来源于肿瘤细胞的这一部分cfDNA被称为循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)[1]。淋巴瘤的传统诊断检测、治疗指导及预后评估均依靠实验室检测指标、影像学与病理活组织检查结果，临床特征及国际预后评分指标(international prognostic index，IPI)，而上述检测指标具有灵敏度与特异度不高、创伤大、具有辐射危害等劣势。ctDNA的出现及其检测技术的提高为临床淋巴瘤的早期诊断，个体化治疗，预后评估，微小残留病(minimal residual desease，MRD)监测提供了新的、灵敏度及特异度高的微创检测方法。笔者拟就ctDNA在淋巴瘤的诊断、预后评估及MRD监测中的研究进展进行综述如下。
1948年，Mandel和Metais发现人体外周血中存在cfDNA。1977年，ctDNA在肿瘤患者外周血中被发现[2]，但是由于缺乏灵敏度高的检测技术，一直难以进行ctDNA相关研究。近年，由于高通量测序技术、深度测序肿瘤个体化建档法(cancer personalized profiling by deep sequencing，CAPP-seq)，磁珠乳液扩增法(beads emulsion amplification magnetics，BEAMing)，目标序列捕获测序(targeted capture sequencing，TCS)，下一代基因测序(next generation sequencing，NGS)等高灵敏度检测技术的出现，使得检测外周血中ctDNA成为可能。由于ctDNA易于获取，越来越多的研究着重评估其用于临床诊断实体肿瘤及评估实体肿瘤预后的可行性，以及与传统检测方式相比，其用于诊断及监测实体瘤的优势。ctDNA来源于肿瘤细胞，仅占cfDNA的很小一部分，肿瘤患者个体间ctDNA水平差异较大，不同研究的结果亦存在较大差异，但是对于ctDNA的特异性特征，不同研究的结果是可重复的，ctDNA可以反映肿瘤发生、发展的部分特征。
Garian等[3]检测82例转移性结直肠癌患者接受治疗前外周血ctDNA的研究接受显示，患者外周血ctDNA中位水平为0.38 ng/mL(0.02～7.73 ng/mL)[3]。Armand等[4]对16例侵袭性非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma，NHL)患者治疗前外周血样本中ctDNA水平进行检测的研究结果显示，ctDNA仅在11例患者外周血样本中被检测到，未检出ctDNA的5例患者中，3例患者肿瘤分期为Ⅰ期，另外2例患者在其外周血单个核细胞中检测到了NHL相关突变基因。Bohers等[5]对12例弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)患者的外周血cfDNA进行研究后发现，患者外周血ctDNA平均水平约为1.65 ng/mL(0.46～11.20 ng/mL)。Jones等[6]研究发现，42例淋巴瘤患者cfDNA水平显著高于13例健康个体，并且差异有统计学意义(1 622 genomes/mL比297 genomes/mL，P<0.000 1)；同时，在淋巴瘤患者治疗前、治疗2个疗程时、治疗3个疗程时、治疗1个月后及治疗6个月后，外周血样本中cfDNA水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。该研究结果表明，cfDNA不能反映肿瘤发生、发展的情况。而ctDNA可以反应疾病发展及归转的情况[3]。Mussolin等[1]研究结果亦证实了这一理论，并且该研究发现，在间变大细胞淋巴瘤(anaplastic large cell lymphoma，ALCL)患者中，不同个体外周血ctDNA中NPM-ALK融合基因水平差异大(范围为1%～100%)。
临床表现观察、血液学检查、影像学检查及活组织检查一直是诊断淋巴瘤的重要方法，但是随着检测淋巴瘤各项新技术的兴起与新型分子标志物的出现，影像学检查技术逐渐显现出弊端，例如影像学检查有着较低的特异度、并且对人体有辐射、费用昂贵等缺点[7,8,9]。活组织检查一直作为淋巴瘤诊断的金标准，亦具有侵入性、不能反映淋巴瘤总体情况等弊端。随着ctDNA检测技术的出现，越来越多的相关临床研究分析淋巴瘤患者外周血ctDNA水平变化与临床特征、实验室相关指标、影像学检查结果的相关性。
临床相关症状及血液学检查结果作为诊断淋巴瘤的辅助指标，有着重要地位，部分患者相关临床症状的出现及血液学检查结果的异常，通常提示疾病发生、进展或复发，临床上多数淋巴瘤患者以相关临床症状出现或偶然体检发现异常而就诊。有研究结果表明，ctDNA在复发淋巴瘤患者相关临床症状出现或影像学检查结果提示异常症状出现前，就能被检测到[10,17]。因此，ctDNA的检测对淋巴瘤的筛查与早期诊断可能具有一定优势[2]。而在淋巴瘤诊断时，ctDNA需要与淋巴瘤的其他相对特异性检测指标作比较，以明确ctDNA与其相关性，判断其用于临床诊断的相对优势。多数研究结果表明，ctDNA的灵敏度与特异度均较相关临床症状与血液学检查结果高[9,10]。
关于淋巴瘤患者外周血ctDNA的研究结果表明，增高的ctDNA水平与疾病进展，B症状出现，增高的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)水平及高龄相关[8]。关于DLBCL患者外周血ctDNA的研究结果显示，未检测到或仅检测到低水平的ctDNA单核苷酸突变(single nucleotide variation，SNV)频率且伴有正常的LDH水平的DLBCL患者分期多为Ⅰ/Ⅱ期；而检测到增高的ctDNA变异等位基因频率(variant allele frequency，VAF)且伴有增高的LDH水平DLBCL患者的分期为Ⅳ期[5]。因此，ctDNA水平可能与DLBCL肿瘤负荷相关。但Mussolin等[1]研究发现，尽管纳入研究的201例Burkitt淋巴瘤患者的外周血ctDNA水平较高，但是其年龄、肿瘤分期、B症状的有无、LDH水平、肿瘤体积与ctDNA水平并无显著相关关系(P>0.05)；在43例霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma，HL)患者中，与年龄≤10岁的患者相比，年龄>10岁者外周血ctDNA水平较高，并且差异有统计学意义(14 ng/mL比114 ng/mL，P＝0.01)；在45例ALCL患者中，外周血ctDNA水平增高与疾病分期(Ⅲ/Ⅳ期)相关(P＝0.01)，ctDNA水平与其他临床参数均无显著相关关系(P>0.05)。有研究对比DLBCL患者的外周血ctDNA水平与LDH水平相关性发现，LDH用于诊断DLBCL的灵敏度仅为59%，而ctDNA可达88%，二者相比，差异有统计学意义(P＝0.01)[9]。Scherer等[10]纳入76例DLBCL患者的研究结果亦显示，LDH用于诊断DLBCL的灵敏度(37%)较ctDNA(100%)低。上述2项研究结果均表明，ctDNA用于诊断DLBCL的灵敏度较高。DLBCL患者外周血ctDNA水平可以反映DLBCL总体肿瘤负荷，并且与肿瘤分期及IPI相关(P＝0.000 3、0.000 1)[10]。在针对滤泡性淋巴瘤患者的相关研究中发现，外周血检出ctDNA与骨髓受累相关(P＝0.005)，而增高的ctDNA水平与外周血存在循环淋巴瘤细胞相关(P＝0.024)[11]。因此，ctDNA作为1种新型分子标志物，与淋巴瘤相关临床表现、组织学特征、肿瘤负荷、实验室检查指标等相关，但是目前尚缺乏一致性结论，需要进一步开展前瞻性研究。
活组织检查一直为确诊淋巴瘤的金标准，淋巴瘤的组织分型依赖于活组织检查结果。活组织检查不仅可以用于检测淋巴瘤细胞表面分子标志物，亦可以用于检测相关突变基因，以便于更好地对淋巴瘤患者进行诊断与治疗。而ctDNA作为新型分子标志物，为判断其用于淋巴瘤诊断的临床价值，有必要将其与金标准进行比较，只有当ctDNA水平与活组织检查结果具有较高的一致性时，才能确定其具有临床应用价值。
在关于HL结节硬化型患者RS细胞(Reed-Sternberg cell)的基因不稳定性研究中，通过荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)检测HL结节硬化型患者肿瘤组织中RS细胞内相关基因片段的插入缺失情况，再对比外周血中的ctDNA检测结果，结果发现在早期与进展期HL结节硬化型患者外周血ctDNA中，可以检测到与肿瘤组织中RS细胞内相同的大部分基因转位，并且有类似于在肿瘤组织RS细胞中发现的基因片段的获得与缺失[12]。该研究结果证实，在HL患者中虽然RS细胞很少，但是存在基因突变的ctDNA仍能在外周血中检测到，因此ctDNA的检测亦可以用于HL的诊断中。因此，ctDNA检测为HL的研究提供了新的方向。在Camus等[13]关于94例经典霍奇金淋巴瘤(classical Hodgkin lymphoma，cHL)患者输出蛋白(exportin，XPO)1基因突变研究中，亦得到了相似的结果。该研究在对比肿瘤组织DNA与ctDNA中XPO1 VAF相关性后发现，ctDNA VAF(平均为0.24%，范围为0.13%～14.74%)与肿瘤组织DNA VAF(平均为0.44%，范围为0.13%～4.78%)相关性较低(r＝0.462，P＝0.038 7)。在关于12例DLBCL患者的ctDNA研究中，将ctDNA与肿瘤组织中的特异性基因突变进行比较后发现，肿瘤组织DNA的平均VAF为35%(17%～64%)，而ctDNA平均VAF为11%(2%～89%)[5]。尽管ctDNA与肿瘤组织DNA平均VAF存在差异，但在检测到基因突变的11例DLBCL患者中，ctDNA中的突变基因与肿瘤组织突变基因相似或部分相似。ctDNA与肿瘤组织DNA的中位基因突变一致率为85%。这表明，ctDNA与肿瘤组织中的基因突变种类有较高的一致性。在Rossi等[14]进行的关于DLBCL基因分型的研究中，为系统性判断ctDNA用于DLBCL基因分型的可行性，将18例DLBCL患者外周血与肿瘤组织中检测到的突变基因进行比较，结果发现在分析肿瘤组织中已检出的基因突变在外周血ctDNA中分布时，ctDNA检测灵敏度可达82.8%(95%CI：74.4%～88.9%)，而在外周血ctDNA中未检测到的突变基因，在肿瘤组织中则通常呈低表达。在检测VAF≥20%的突变基因时，与VAF<20%的突变基因相比，ctDNA的检测灵敏度显著增高。这表明，ctDNA可以更精确地反映突变频率较高的等位基因变化情况。Scherer等[10]亦发现，DLBCL患者外周血的ctDNA与肿瘤活组织中的DLBCL相关突变基因的一致率为88%，因此可以通过检测DLBCL患者外周血ctDNA中肿瘤亚型特异性突变基因，进行肿瘤细胞来源分层，将DLBCL分为生发中心B细胞样弥漫性大B细胞淋巴瘤(germinal center B-cell like diffuse large B cell lymphoma，GCB-DLBCL)与非GCB-DLBCL。上述研究结果均表明，ctDNA检测淋巴瘤的灵敏度与特异度均较高，与活组织检查结果有较高的一致性。
此外，ctDNA检测亦具备活组织检查所不具备的优势。多项研究发现，在淋巴瘤患者外周血ctDNA中可检测到在肿瘤组织未发现的基因突变[10,11,14]。ctDNA可以由全身肿瘤组织释放，能够反映整体肿瘤基因突变情况与肿瘤负荷，并且由于其创伤性小，可以实时监测，而活组织检查仅能反映某一肿瘤部位当时情况，取材受个体身体状况限制较大。虽然ctDNA检测具有较大优势，但目前仍没有研究结果能够证实其可以完全取代活组织检查成为诊断肿瘤的金标准，ctDNA具有取代活组织检查检测耐药突变基因的潜力，指导患者个体化治疗，或者作为活组织检查的补充，检测新突变基因。
新型分子标志物的出现及诊断分型分期的明确均为寻找合适的淋巴瘤治疗方法提供了基础，ctDNA的出现将淋巴瘤的治疗带入创伤性小、可以实时监测、灵敏度与特异度均较高的个体化治疗阶段。ctDNA可以监测耐药基因突变的出现，为及时调整治疗方案提供有效的、可靠的实验室检测证据[14]。淋巴瘤患者诊断时，检测ctDNA水平可以反映肿瘤负荷；治疗过程中，ctDNA水平可以反映治疗效果；治疗后，ctDNA水平可以反映微小残留病(minimal residual disease，MRD)的存在情况[13]，这为淋巴瘤的预后评估及复发监测提供了有效的检测方法。大部分研究结果证实，ctDNA对淋巴瘤复发监测与预后评估的灵敏度高于现有的影像学检查技术[15,16,17]。
随着ctDNA检测技术灵敏度的进一步提高，利用在治疗过程中对ctDNA的监测，有可能在疾病治疗阶段通过调整治疗方案，就能够尽量彻底消灭MRD，从而改善淋巴瘤的整体疗效。淋巴瘤疾病监测的传统手段为影像学及血液学检查，而利用ctDNA监测MRD可能更及时地发现复发。研究将ctDNA的监测与传统手段进行对比研究发现，影像学及血液学检查结果局限性较大，灵敏度与特异度均较低，部分既往被定义为完全缓解(complete remission，CR)的淋巴瘤患者外周血中仍可以检测到ctDNA，而该部分患者在随访中几乎全部复发[10]。外周血ctDNA水平变化与淋巴瘤患者预后相关，ctDNA检测结果呈阴性的DLBCL淋巴瘤患者的无进展生存(progression-free survival，PFS)率高于ctDNA阳性者(P<0.05)[10,17]。动态监测50例NHL患者从确诊至复发期间ctDNA水平变化情况的结果显示，对于治疗有效的NHL患者，其血浆ctDNA的平均等位基因突变频率为12.60%(0.17%～80.40%)，并且当治疗进行至第2个疗程时，血浆ctDNA的平均等位基因突变频率减低为0；而当NHL出现进展或复发时，患者血浆ctDNA的平均等位基因突变频率为14.30%(0.65%～65.30%)，并且在化疗的第2、3个疗程及治疗结束时，其血浆ctDNA均可检测到，血浆ctDNA的平均等位基因突变频率分别为20.20%(0.17%～80.40%)、18.80%(1.10%～61.10%)及8.20%(0.10%～34.20%)[14]。该研究中，ctDNA的检测灵敏度显著高于已报道的影像学检查的检测灵敏度[14,15]。Kwok等[16]所得研究结果亦与上述研究结果相似，并且研究结果证实ctDNA可以在诊断时检测多种基因突变，以及在治疗过程中监测基因突变的改变情况，检测ctDNA可以评估MRD，从而评估疾病预后。有研究通过比较17例NHL患者治疗前、后外周血ctDNA水平发现，治疗后ctDNA检测结果呈持续阴性的淋巴瘤患者，在随访过程中无复发[4]。
目前，外周血ctDNA在实体肿瘤中研究较多，但是在淋巴瘤等血液系统肿瘤研究中仍较少，这些淋巴瘤ctDNA的相关研究成果与其他实体肿瘤研究结果相一致[18,19,20]。淋巴瘤较其他实体肿瘤在治疗上极少依赖手术切除，主要通过化疗及放疗等治疗手段进行治疗。因此，ctDNA检测在淋巴瘤中的应用尤其重要。在淋巴瘤领域的ctDNA相关研究主要针对NHL中DLBCL、滤泡细胞淋巴瘤、HL等B细胞淋巴瘤，而对T细胞淋巴瘤研究较少。这可能是因为T细胞淋巴瘤的基因突变较多，特异度较差，在疾病进展中容易出现克隆演变，从而使得ctDNA检测相对困难[21,22,23,24]。在淋巴瘤中DLBCL的发病率较高[25,26]，并且B细胞淋巴瘤有相对较特异的免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)重排，能够较特异性地反映患者体内基因突变情况[9,11]。ctDNA在淋巴瘤中的应用仍不成熟，需要更多的研究来进一步论证，亦需要研究更多种类的淋巴瘤，以明确其在全部淋巴瘤中的有效性。
外周血ctDNA在淋巴瘤的诊断、治疗与随访全程应用可能改善淋巴瘤患者的总体预后，早期ctDNA检测不仅有助于淋巴瘤的诊断，亦可以通过其水平反映肿瘤负荷有助于预后判断[7]，并结合ctDNA水平的动态变化监测病情变化。治疗过程中，ctDNA水平的逐渐减低通常提示治疗有效，如果治疗过程中及结束后仍可以检测到ctDNA，通常表明药物疗效较差，患者可能存在耐药基因突变，提示需要采用联合用药或者更换药物[14]。治疗结束后，如果淋巴瘤患者达到CR，后期可以定期监测其ctDNA水平，以监测疾病复发。
目前，由于ctDNA尚处于早期研究阶段，无标准化的检测技术与数值指标，ctDNA的检测仍有较多局限性，尚无法用于淋巴瘤的临床常规检测；ctDNA检测技术费用仍较高，作为疾病早期筛查方法的成本大。外周血ctDNA检测灵敏度与特异度虽然较高，目前仍无法取代活组织检查，其无法对基因突变进行溯源。目前对于ctDNA基因突变的检测均为基于肿瘤活组织检查而得出的结果，如果ctDNA中检测出新突变基因，该如何定义该基因突变性质仍需要活组织检查来明确。因此，ctDNA仅能作为活组织检查的补充，或者部分替代活组织检查。淋巴瘤中ctDNA的相关研究才刚起步，迫切需要更多大样本、多中心研究探索如何合理地将ctDNA应用于淋巴瘤的诊断、治疗与监测中。
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