多发性骨髓瘤(MM)为常见的血液系统恶性肿瘤，发病率高且预后差。目前，MM的常规治疗手段包括细胞毒性药物化疗、蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂等药物治疗，以及造血干细胞移植(HSCT)，但是疗效均不理想。近年，嵌合抗原受体(CAR)-T细胞免疫疗法用于MM的治疗已取得一定研究进展。笔者拟就CAR-T细胞的结构、作用靶点及其应用于MM临床治疗的情况，以及现阶段存在的缺陷及应对措施进行综述，旨在为CAR-T细胞用于治疗MM提供参考依据。
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目前，多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)的常规治疗手段包括细胞毒性药物化疗、蛋白酶体抑制剂(硼替佐米)、免疫调节药物(来那度胺)及皮质类固醇等药物治疗[1]，以及造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)，但是疗效均不佳，患者最终发生复发、进展。免疫疗法，如树突状细胞的免疫治疗，一直是MM新型治疗手段的研究热点，但是由于其疗效不能维持，导致其应用受限。嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)为一种人工融合蛋白，其融合了抗原识别区域和T细胞信号区域。目前，CAR-T细胞免疫疗法作为治疗复发/难治性MM的新型治疗手段，在一些临床试验中取得了进展。笔者拟就CAR-T细胞的结构、作用靶点及CAR-T细胞免疫疗法治疗MM的临床应用的研究进展，以及现阶段存在的缺陷及应对措施综述如下。
T细胞的活化过程依赖于双信号系统共同的作用：第一信号由T细胞受体(T cell receptor，TCR)与Ⅰ、Ⅱ类主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex，MHC)结合；第二信号主要由抗原递呈细胞上的B7家族分子与其在T细胞上的配体CD28相结合产生协同刺激信号(B7/CD28协同刺激信号)。CAR-T细胞是采用基因工程的方法，将识别目标抗原的单链抗体与间隔区、跨膜基序和T细胞的活化基序等融合形成融合基因，并且利用该融合基因修饰T细胞。CAR-T细胞既能特异性识别并结合肿瘤抗原，又具备T细胞的自我更新和杀伤能力，可不受肿瘤局部微循环免疫抑制，以非MHC限制性的方式特异性杀伤肿瘤细胞[2]。
CAR的模块化结构主要包括细胞外抗原结合区、跨膜区和细胞内信号转导区[3]。细胞外抗原结合区为单克隆抗体的单链可变区(single chain variable fragment，scFv)，由轻链和重链共同组成，能够识别特定的肿瘤抗原，或者细胞因子、激素的信号肽及细胞膜受体的胞外区。目前，已有多种肿瘤抗原可被细胞外抗原结合区识别，包括CD19，CD20，B淋巴细胞成熟抗原(B-cell maturation antigen，BCMA)，表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)，前列腺特异性膜抗原(prostate specific membrane antigen，PSMA)，人类表皮生长因子受体(human epidermal growth factor receptor，HER)-2和碳酸酐酶(carbonic anhydrase，CA)Ⅸ等[4]。跨膜区可能来源于Ⅰ型跨膜蛋白，如CD4、CD8或CD28等。细胞内信号转导区主要为TCR/CD3的ζ链、免疫球蛋白Fc受体FcεRⅠγ链或者CD3ε链。
随着相关研究的深入，CAR的种类不断增加。目前，主要根据细胞内信号转导区的结构域数目不同，将CAR分为4代。第1代CAR仅包含单一的信号分子，缺乏肿瘤细胞表面共刺激分子。所以，这一代的CAR虽然能够识别靶抗原并激活T细胞。但是由于不能转导诱导细胞因子和T细胞增殖信号，CAR-T细胞难以充分活化，在体内存在时间较短，抗肿瘤效应欠佳。为了使CAR-T细胞更好地活化，第2代CAR进一步在细胞内增加共刺激分子的细胞内信号转导结构域，如CD19、CD27、CD28、CD134、共刺激分子4-1BB，以及可诱导共刺激分子(inducible costimulatory molecule，ICOS)等。第2代CAR在识别靶抗原后，能同时活化细胞内信号转导结构域和共刺激分子，提供双重活化信号，提高更持续的抗肿瘤效应[5]。第3代CAR主要是在细胞内信号转导区整合了2个以上的共刺激分子，以进一步增强CAR-T细胞的活化。第4代CAR，即应用编码CAR和(或)CAR反应性启动子的载体构建CAR，在细胞因子作用下，CAR产生有效信号，而这些细胞因子还可以招募免疫系统的其他成分使抗肿瘤效应进一步放大[6]。
CAR-T细胞免疫疗法用于治疗MM的最大挑战是找到合适的靶抗原。作为靶抗原应达到以下3个要求：①靶抗原必须能在肿瘤细胞表面表达；②靶抗原的离体肿瘤表达水平即使很低，也不能存在于某些重要的器官或者细胞(造血干细胞)中；③为了避免抗原逃逸，所有肿瘤细胞必须表达靶抗原，或者靶抗原必须是维持肿瘤细胞致瘤表型所必需的。上述第1个要求是MHC非依赖性抗体结合的性质所决定的。第2个要求是基于CAR-T细胞的毒性特征。这要求，在肿瘤细胞中、低水平表达的靶抗原可以被迅速裂解。例如，以CAⅨ为靶抗原的CAR-T细胞，由于CAⅨ在胆管上皮细胞中存在低水平表达，从而导致CAR-T细胞介导的胆管炎等不良反应[7]。此类不良反应反映了CAR-T细胞对其靶抗原参与的信号转导的敏感性。第3个要求已经在临床研究中显现。例如，在利用CD19-CAR-T细胞治疗B细胞急性淋巴细胞白血病的1项临床试验中，1例肿瘤细胞表达CD19的患者在CAR-T细胞诱导的初始完全应答后，可能复发不同种类的CD19呈阴性肿瘤[8]。因此，寻找最合适的靶抗原用于靶向治疗，可以说是研发CAR-T细胞免疫疗法中最重要的组成部分。
CD19-CAR-T细胞是目前应用最为广泛和成功的CAR-T细胞[9]。CD19是在前体和成熟B细胞膜上表达的抗原，表达于各种B细胞恶性肿瘤，包括B细胞急性淋巴细胞白血病/淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤[10]。CD19-CAR-T细胞已经被用于治疗表达CD19的B细胞恶性肿瘤[11]。MM细胞通常不表达流式细胞术和免疫组织化学等常规检测方法可以检出的CD19，但是由于MM祖细胞可能起源于B细胞，MM细胞可能表达低水平CD19，该表达水平可能足以用于治疗MM。目前，CD19-CAR-T细胞可用于接受自体造血干细胞移植(autologous hematopoietic stem cell transplantation，auto-HSCT)后，复发/难治性MM患者的挽救性治疗。Garfall等[12]采用CD19-4-1BB-CD3ζCAR-T细胞的慢病毒转导产物，即细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)019治疗1例复发/难治性MM患者，该患者先、后接受高剂量的美法仑和auto-HSCT治疗，2周后接受CTL019输注。该患者在治疗过程中，未发生发热或者低血压等细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome，CRS)临床表现；在接受CTL019输注47 d后，其外周血中仍然可以检出CTL019；接受CTL019输注3个月后，骨髓活组织检查结果显示，浆细胞比例为1%～2%，提示该患者获得严格意义的完全缓解(complete response，CR)，并且无CRS相关临床表现；接受治疗后数月，未出现MM相关临床症状或者体征，同时非肿瘤性CD19 B细胞获得重建，CTL019在骨髓、血液中均未被检出；接受CTL019输注12个月后，疗效评估结果表明，该患者持续获得CR。目前，已经有10例MM患者接受CTL019治疗，其中2例患者在联合高剂量美法仑治疗后，获得长期无进展生存(progression free survival，PFS)，并且该患者的长期PFS期与其骨髓CTL019峰值相关，而与外周血CTL019峰值或者CLT019持续时间无关[12]。
CD138亦被称为多配体蛋白聚糖-1(syndecan-1)，是1种在人类浆细胞包括MM细胞上，高表达的细胞膜蛋白。CD138发挥黏附蛋白的作用，结合位于细胞外基质中的胶原和纤连蛋白分子。由于CD138在MM细胞上高度表达，因此CD138被认为是重要的CAR-T细胞靶抗原。2016年，中国人民解放军总医院的Guo等[13]采用CD138-CAR-T细胞治疗5例难治性MM患者，患者接受3～6次CD138-CAR-T细胞输注，平均输注CD138-CAR-T细胞数为7.56×106个/kg；患者接受CD138-CAR-T细胞治疗3个月后，骨髓中仍然可以检出CD138-CAR-T细胞，其中4例患者病情稳定(stable disease，SD)3～7个月，1例患者疾病进展(progressive disease，PD)后转为接受姑息治疗。但是，该研究数据较为有限，因此应该谨慎评估。尽管CD138作为MM的靶抗原具有吸引力，但是其确实存在潜在的缺点。首先，CD138广泛表达于上皮组织，CD138-CAR-T细胞可能引起皮肤和(或)黏膜的不良反应(黏膜炎、口腔炎及手足综合征)；其次，肿瘤细胞表面脱落的CD138，可能成为CD138-CAR-T细胞的潜在诱导物，引起全身性炎症反应。因此，笔者推测，未来针对CD138-CAR-T细胞治疗MM的研究方向，重点在于避免潜在不良反应，同时保持潜在的抗肿瘤效应。
鉴于成熟的B淋巴细胞表达κ或者λ轻链，以B细胞表达抗原为CAR-T细胞靶抗原的缺点是引起低免疫球蛋白血症，并且导致患者较严重的免疫抑制。由于MM细胞对κ或者λ轻链单克隆抗体的限制表达，可以采用κ或者λ轻链作为单克隆受体，从而使正常B细胞免受CAR-T细胞杀伤。近期研究结果显示，能够识别限制性表达κ轻链单克隆抗体MM细胞的κ轻链CAR-T细胞，可用于MM治疗，7例MM患者接受12.5 mg/kg环磷酰胺后，给予1～2次κ轻链与CD28-CD3ζ-CAR-T细胞构建体(κ轻链CAR-T细胞)输注，患者接受治疗后，外周血B细胞计数下降至治疗前2周的50%，并且外周血B细胞减少主要是κ轻链导致；7例MM患者中，4例输注κ轻链CAR-T细胞后表现为SD(SD期>24个月)或者MM症状得到总体改善[14]。由于慢性淋巴细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤患者的κ轻链表达水平较MM患者高，前者对κ轻链CAR-T细胞的疗效更可靠，MM患者对κ轻链CAR-T细胞具有良好的耐受性，并且无严重CRS不良反应。但是其缺点在于MM细胞κ轻链分泌能力强，而其细胞表面的抗原表达很弱，可能导致抗肿瘤效应减弱。
B细胞成熟抗原(B cell maturation antigen，BCMA)在所有肿瘤性浆细胞均高度表达，并且在细胞抗凋亡信号通路中发挥重要作用，是用于CAR-T细胞免疫治疗最理想的靶抗原[15]。BCMA属于肿瘤坏死因子受体超家族(tumor necrosis factor receptor super family，TNFRSF)17成员，在调节B细胞成熟和分化为浆细胞方面发挥重要作用[16]。BCMA为Ⅲ型跨膜蛋白，缺乏信号肽，但是含有富含半胱氨酸的细胞外结构域，能够促进B细胞的存活和分化[17]。BCMA于B细胞向成浆细胞分化过程中产生，而在幼稚B细胞或者造血干细胞上不表达。最近研究发现，BCMA在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)细胞系中存在异常表达，并且可能通过细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)1/2信号通路在NSCLC的发生、发展中发挥作用[18]。2016年，Ali等[19]进行了1项关于第2代BCMA-CAR-T细胞的Ⅰ期临床试验队列研究，12例患者接受3×300 mg/m2环磷酰胺和3×30 mg/m2氟达拉滨化疗后，分别接受4个递增剂量的BCMA-CAR-T细胞输注：0.3、1.0、3.0、9.0×106/kg。该研究结果显示，患者输注BCMA-CAR-T细胞后，高BCMA-CAR-T细胞剂量组患者的不良反应(包括CRS)较低剂量组更严重；12例患者体内检出的BCMA-CAR-T细胞数呈给药剂量依赖性；12例患者的治疗反应包括，1例患者获得严格意义的CR，2例获得非常好的部分缓解(very good partial remission，VGPR)，1例获得部分缓解(partial remission，PR)，8例SD期长达16周；9.0×106/kg BCMA-CAR-T细胞剂量组患者的疗效最佳；仅1例患者骨髓中的BCMA呈阴性MM细胞发生恶性克隆，导致MM复发[19]。
另外2种BCMA-CAR-T细胞产物亦已经进入临床试验阶段。相关试验结果在2016年美国血液学年会(American Society of Hematology，ASH)会议上被提出。宾夕法尼亚大学的Cohen等[20]报道1项采用BCMA-CAR-T细胞产物(第2代4-1BB-CD3ζ-BCMA-CAR-T细胞)治疗6例MM患者的研究，该6例患者分3次接受递增剂量的BCMA-CAR-T细胞输注(第0天输注剂量为总剂量的10%，第1天为30%，第2天为60%)。该研究结果显示，6例患者中，5例出现CRS不良反应，2例需要采用妥珠单抗治疗，并且接受妥珠单抗治疗的2例患者由于发热，仅接受40%总剂量的BCMA-CAR-T细胞输注。尽管这2例患者在治疗过程中，采用妥珠单抗和不完全剂量的BCMA-CAR-T细胞输注，但是分别获得严格意义的CR和VGPR的抗肿瘤治疗反应。其中，疗效达CR的1例患者在接受治疗7个月后，血液和骨髓中仍然可以检出BCMA-CAR-T细胞；疗效达VGPR的1例患者在接受治疗5个月后，发生PD，这可能与其外周循环中BCMA-CAR-T细胞减少有关，进一步分析其肿瘤细胞表面BCMA的表达水平发现，BCMA丢失，这提示发生抗原逃逸。其余4例患者疗效分别为1例SD，2例获得最小反应，1例PD。该研究还报道了1例MM患者输注BCMA-CAR-T细胞后，发生后部可逆性脑病综合征(posterior reversible encephalopathy syndrome，PRES)的神经系统不良反应，该例患者接受环磷酰胺治疗后，PRES得到逆转。由此推测，CRS引起的相关高水平细胞因子会导致PRES。此外，该研究结果还证实，环磷酰胺不仅可以有效逆转危及生命的类固醇难治性CAR-T细胞的神经毒性，还可以保留部分CAR-T细胞的抗肿瘤效应和持续性[21]。西安交通大学医学院第二附属医院的Zhang等[22]亦进行了相关研究，34例复发/难治性MM和2例浆细胞白血病患者接受LCAR-B38M-BCMA-CAR-T细胞治疗的Ⅰ期临床试验结果显示，36例患者均获得缓解，其中15例达到CR。但值得注意的是，在该试验中的所有患者均为接受3线治疗方案后，接受BCMA-CAR-T细胞治疗。
2016年12月，Berdeja等[23]报道了采用包含4-1BB共刺激结构域的BCMA-CAR-T细胞(Bb2121)治疗复发/难治性MM患者的队列研究数据。9例复发/难治性MM患者在接受环磷酰胺、氟达拉滨化疗后，被分为3组(每组3例患者)，分别接受5、15、45×107个Bb2121的单次输注。在接受Bb2121的所有患者体内，均可观察到CAR-T细胞的持续和扩增。在输注Bb2121 4～24周后，15×107个Bb2121剂量组患者的疗效最佳，其中2例患者获得CR，1例获得VGPR；5×107个Bb2121剂量组和45×107个Bb2121剂量组患者的疗效相当，获得PR、SD和PD的患者均各为1例，并且于输注8～11周后，达到PR和SD的患者均发生PD。
总体而言，BCMA作为CAR-T细胞免疫疗法的靶抗原具有一定应用前景。从上述试验结果可见，目前对BCMA-CAR-T细胞构建结构，剂量水平，以及导致的不良反应等因素，如何影响免疫治疗的疗效仍有待进一步探讨。不同的选择标准，可能会影响试验之间BCMA-CAR-T细胞治疗MM的疗效和持续性。但是MM细胞表面BCMA的表达阈值及BCMA呈阴性MM细胞的鉴定，以及MM环境中T细胞动力学，将对BCMA-CAR-T细胞的耐药机制研究具有重要意义。
CD38是1种Ⅱ型跨膜糖蛋白，是与转铁蛋白受体和人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)分子等蛋白质结构相关的细胞表面抗原。由于CD38具有在恶性浆细胞上长期表达的特点，使其成为CAR-T细胞治疗具有吸引力的靶点之一。
在临床前试验中，CD38-CAR-T细胞对来自MM患者的骨髓瘤细胞显示出疗效[24,25]。但是CD38亦表达于活化的T细胞，这可能导致CD38-CAR-T细胞的"自相残杀"[26]。此外，CD38亦在一些正常非造血组织蛋白表达。当CD38-CAR-T细胞以上述蛋白作为靶点时，可能会引起机体广泛的免疫反应。因此，还需考虑将CD38-CAR-T细胞与地塞米松或(和)泊马度胺等联合，用于MM患者的治疗。
CAR相关不良反应包括非肿瘤靶向毒性和全身性不良反应。因此，研发新的CAR的主要挑战就是找到合适和特异性靶抗原。理想状态下，靶抗原应具有肿瘤特异性，并且在限制抗原逃逸方面发挥重要作用，同时在正常组织中表达水平极低甚至不表达。
目前避免CAR相关不良反应的主要措施包括以下2种。①考虑在CAR-T细胞中掺入"自杀基因"，允许在不良反应发生时清除CAR-T细胞[27]。该方法是否有效，取决于CAR-T细胞清除的程度和速度。由于CAR-T细胞清除的程度和速度，取决于所掺入的"自杀基因"，所以"自杀基因"的选择尤为重要。②通过基因工程改造CAR-T细胞，使CAR-T细胞可以表达特异性趋化因子受体，从而使其趋向于肿瘤环境或者最少量的到达非肿瘤部位[28]。共同抑制受体(inhibitory chimeric antigen receptor，iCAR)亦在研究中，iCAR可以使CAR-T细胞在识别肿瘤细胞的过程中，忽略正常组织[29]。这种想法虽然可行，但是需要明确iCAR识别的抗原仅表达于正常组织，而在肿瘤细胞中不表达。
CAR-T细胞免疫治疗在临床治疗多种恶性肿瘤患者的同时，亦可导致其他不良反应，需要引起临床足够的重视。CAR-T细胞的首要不良反应是脱靶效应(on-target off tumor effect)，脱靶效应常见于CAR-T细胞治疗实体肿瘤患者。引起脱靶效应的主要原因是，CAR定向的靶抗原肿瘤细胞特异性不佳，靶抗原在正常组织亦存在不同程度表达。因此，对靶抗原亲和力强、杀伤能力强的CAR-T细胞在清除肿瘤的同时，亦攻击正常组织。例如，采用CD19-CAR-T细胞治疗MM时，部分患者出现B细胞缺乏等不良反应[30]。避免脱靶效应可采取以下措施：①选择特异性表达于肿瘤表面的抗原作为靶抗原；②CAR-T细胞设计表达1种以上的CAR，使CAR-T细胞特异性清除肿瘤细胞；③考虑引入"自杀基因"，如凋亡诱导融合蛋白Fas和caspase 9，采用化学诱导剂激活，在肿瘤细胞被完全清除后，表达"自杀基因"蛋白的CAR-T细胞可被选择性清除[31]；④输注免疫球蛋白治疗CD19-CAR-T细胞免疫治疗所致的B细胞缺乏。
"细胞因子风暴"，即CRS亦是CAR-T细胞免疫疗法中常见的致死性不良反应。在CAR-T细胞治疗血液系统恶性肿瘤的多项临床试验中，CRS均有发生；在大部分血液系统恶性肿瘤患者中，CRS的轻微症状包括发热和轻度低血压等流感样症状；更严重的不良反应包括低血压、缺氧、毛细血管渗漏和凝血障碍，而这些不良反应均可能导致致死性多器官功能障碍[32]。CRS是由于T细胞被活化后，在短时间内清除肿瘤细胞的同时，产生"溶瘤效应"，引起炎症反应，释放出大量细胞因子造成。虽然CAR-T细胞治疗MM的疗效不能根据CRS严重程度进行预测，但是大部分对CAR-T细胞治疗有反应的MM患者确实经历了一定程度的CRS。在CRS被明确为CAR-T细胞不良反应后，治疗上需要选择合适的治疗方法来抑制CRS引起的炎症反应，但是不降低CAR-T细胞的疗效。因此，需要考虑采取以下措施达到该目的。①寻找更安全的CAR，并且严格控制每次输注的CAR-T细胞数量。②治疗过程中，可加入类固醇激素或者细胞因子拮抗剂。CRS的治疗可以采用全身糖皮质激素，通过长期(给药时间>14 d)糖皮质激素治疗，可以抑制或者消除CAR-T细胞引起的CRS不良反应。目前，鉴于白细胞介素(interleukin，IL)-6是CRS的主要介质，IL-6拮抗剂(塔西单抗)亦被用于治疗CAR-T细胞引起的CRS[33]。关于IL-6拮抗剂预防CART-T细胞免疫疗法引起的CRS的效果与CAR-T细胞增殖、持久性和抗肿瘤效应相关的研究仍在进行中，但是早期研究结果表明，使用IL-6拮抗剂不影响CAR-T细胞的抗肿瘤效应[33]。③尽量在降低肿瘤负荷的前提下，再考虑采用CAR-T细胞免疫疗法。
CAR-T细胞治疗MM的临床试验仍在进行中，初步的研究结果较好，并且证实CAR-T细胞是有效治疗MM的策略。但是患者免疫系统导致的免疫抵抗，仍然是CAR-T细胞免疫疗法疗效难以维持的主要障碍。因此，克服免疫抵抗机制来达到最大的治疗反应效果，同时将CAR-T细胞免疫治疗相关不良反应最小化是至关重要的。
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