探讨山东省潍坊市无偿献血者血液标本核酸与血清学的联合检测，在血液筛查中的应用。
选择2016年6月至12月，于潍坊市中心血站参加无偿献血的55 852例无偿献血者作为研究对象。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)对无偿献血者的血浆标本进行血清学检测，检测项目包括HBsAg、抗-丙型肝炎病毒(HCV)、抗-人类免疫缺陷病毒(HIV)、抗-梅毒螺旋体(TP)及丙氨酸氨基转移酶(ALT)。对于ELISA检测结果呈阴性的血浆标本，分别采用上海科华生物工程股份有限公司和瑞士诺华诊断公司的病毒核酸检测系统，进行核酸扩增技术(NAT)检测，检测项目包括HBV DNA、HCV RNA及HIV RNA。对于ELISA检测HBsAg呈阴性，而NAT拆分试验和鉴定试验检测HBV DNA呈阳性的血浆标本，进行HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb及HBcAb的乙型肝炎病毒(HBV)5项病毒标志物检测，并且根据HBV 5项病毒标志物检测结果，推测献血者HBV感染情况。采用χ2检验的统计学方法，比较NAT检测中，科华病毒核酸检测系统和诺华病毒核酸检测系统的血浆标本核酸阳性检出率；以及采用连续性校正χ2检验，比较科华病毒核酸检测系统的有效拆分率和诺华病毒核酸检测系统的鉴定试验对血浆标本HBV DNA、HCV RNA及HIV RNA的阳性检出率。
①本研究55 852份无偿献血者血浆标本中，ELISA检测结果呈阳性的血浆标本为1 962份。ELISA检测结果呈阴性的53 890份血浆标本中，NAT检测结果呈阳性血浆标本为19份，占0.035%。②本研究进行NAT检测的血浆标本为53 890份。其中，科华病毒核酸检测系统的血浆标本核酸阳性检出率为0.014%(4/28 199)，诺华病毒核酸检测系统的血浆标本核酸阳性检出率为0.058%(15/25 691)，二者比较，差异有统计学意义(χ2＝7.50，P<0.05)。③本研究科华病毒核酸检测系统的有效拆分率为44.4%(4/9)，诺华病毒核酸检测系统的鉴定试验对血浆标本HBV DNA、HCV RNA及HIV RNA的阳性检出率为50.0%(15/30)，二者比较，差异无统计学意义(χ2＝0.03，P＝0.87)。④本研究18例无偿献血者的HBsAg ELISA检测结果呈阴性、HBV DNA NAT检测结果呈阳性。其HBV5项病毒标志物检测结果显示，18例献血者存在5种血清学感染模式，其中隐匿性HBV感染占88.9%(16/18)，可疑"窗口期"HBV感染占11.1%(2/18)。
无偿献血者血液筛查中，ELISA血清学检测存在一定的漏检风险，NAT核酸检测是对ELISA的有效补充。混合样品检测的方法可能降低病毒核酸阳性检出率，从而影响NAT检测的灵敏度。经输血传播HBV的风险需引起潍坊市采供血机构的高度警惕。核酸检测作为血清学检测的补充方法，可以进一步降低经输血传播HBV的风险，对保障血液安全具有重要的作用。
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无偿献血者捐献的血液经HBsAg，抗-丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)和抗-人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)的酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)血清学筛查后，血液安全得到了极大的提高。但是由于ELISA检测存在"窗口期"较长，以及病毒变异、免疫静默感染等问题，导致经输血传播疾病的风险仍然存在。核酸扩增技术(nucleic acid amplification testing，NAT)作为直接检测病原体核酸的技术，通过对靶核酸进行直接扩增或者对其携带的特异性DNA或RNA片段进行扩增，使肉眼不可见的极微量的核酸，转化为直观的光、电或者可视信号。其病毒检测灵敏度较ELISA高，可以有效缩短无偿献血者病毒检测的"窗口期"，并且可以筛查早期急性病毒感染的献血者，从而进一步降低经输血传播疾病的风险[1]。根据2013年国家卫生计生委提出的"积极推进血站核酸检测工作，提高血站实验室检测能力，到2015年，血液筛查核酸检测基本覆盖全国"要求[2]。山东省潍坊市中心血站于2015年先后引进上海科华生物工程股份有限公司和瑞士诺华诊断公司的病毒核酸检测系统，对无偿献血者血液标本进行ELISA双试剂检测，剔除HBsAg，抗-HCV，抗-HIV，抗-梅毒螺旋体(Treponema pallidum，TP)及丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)双试剂呈反应性的标本后，进行NAT检测，进一步筛查血清学检测可能漏检的标本。从而降低了病毒"窗口期"经输血传染的风险。本研究通过对比分析ELISA和NAT 2种检测方法，以及2个厂家病毒核酸检测系统的乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV), HCV及HIV阳性检出率，旨在评价血清学和核酸检测在无偿献血血液筛查中的检测能力。现将研究结果报道如下。
选择2016年6月至12月，于潍坊市中心血站参加无偿献血的55 852例无偿献血者作为研究对象。研究对象纳入标准：①年龄为18～60岁，②献血者的健康检查符合《献血者健康检查要求》(GB18467－2011)相关规定。研究对象排除标准：献血者的血液标本因溶血、严重脂肪血或者污染，而干扰检测结果者。55 852例无偿献血者中，男性献血者为32 860例，女性为22 992例，平均年龄为34.5岁(18～60岁)。献血者献血前，于手肘静脉采集全血标本10 mL，其中5 mL全血采用乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)-K2抗凝真空采血管采集，采血管于1 880×g，离心10 min，分离血浆。所分离的血浆于2～8 ℃冰箱保存，用于血清学检测；5 mL全血采用含惰性分离胶的EDTA-K2抗凝真空采血管采集，于采集后4 h内，1 100×g，离心20 min分离血浆，血浆于2～8 ℃保存，用于核酸检测。
HBsAg检测试剂盒(ELISA法)[批号：201601021，上海科华生物工程股份有限公司；批号：2015115141，英科新创(厦门)科技有限公司]。抗-HCV检测试剂盒(ELISA法)[批号：C20151224，北京万泰生物药业有限公司；批号：2015125824，英科新创(厦门)科技有限公司]。抗-HIV试剂盒(ELISA法)(批号：2015122508，珠海丽珠医药集团股份有限公司；批号：201512004，北京科卫临床诊断试剂有限公司)。抗-TP检测试剂盒(ELISA法)[批号：2015127529，英科新创(厦门)科技有限公司；批号：2016010108，珠海丽珠医药集团股份有限公司]。ALT检测试剂盒(速率法)(批号：150721，北京中生北控生物科技股份有限公司；批号：20150911109，上海荣盛生物药业有限公司)。乙肝五项检测试剂盒(ELISA法)(批号：20170501，潍坊三维生物工程集团有限公司)。HBV、HCV、HIV-1核酸检测试剂盒(PCR荧光法)(批号：20160207，上海科华生物工程有限公司)；HBV、HCV、HIV-1核酸检测试剂盒、鉴别探针试剂盒(转录介导的核酸扩增检测技术-化学发光法)(批号：149043，瑞士诺华诊断公司)。Microlab Star型全自动加样系统(瑞士Hamilton公司)，FAME全自动酶免分析仪(瑞士Hamilton公司)，8420型离心机(日本久保田公司)。Microlab Star型核酸提取系统(瑞士Hamilton公司)，ABI7500型实时荧光定量PCR扩增系统(美国ABI公司)，KH120R型低温离心机(上海科华生物工程有限公司)，BSC-150011B2-X型生物安全柜(济南鑫贝西生物技术有限公司)，Tigris型病毒核酸检测系统(瑞士诺华诊断公司)。
血清学检测均采用ELISA双试剂检测方法。于献血者全血标本采集次日13∶00前，采用2个不同厂家生产的ELISA试剂盒，对55 852份血浆标本进行ALT及HBsAg、抗-HCV、抗-HIV、抗-TP的ELISA检测。试验操作过程严格按照试剂盒和仪器说明书，以及《血站技术操作规程(2015版)》[3]进行。HBsAg、抗-HCV、抗-HIV及抗-TP的ELISA检测结果的灰区设置为50%临界值(cut off值)。若0<标本检测结果<0.5倍临界值，即该标本检测结果呈无反应性；若标本检测结果≥0.5倍临界值，即判定该标本检测结果呈反应性。若标本的双试剂检测结果均呈无反应性，则可判断该标本所检测项目呈阴性；若标本的双试剂检测结果均呈反应性，则可判断该标本所检测项目呈阳性；若标本的单试剂检测结果呈反应性，则该标本需进行双孔复检。复检结果中，若双孔的检测结果均无反应性，则判定该标本所检测项目呈阴性；若任意1个孔的检测结果呈反应性，则判定该标本所检测项目呈阳性。ALT的检测结果判读：若ALT双试剂检测结果均>50 U/L，则可判定该标本为ALT呈阳性，双试剂检测结果均≤50 U/L，则可判定该标本为ALT呈阴性；若标本的单试剂检测结果>50 U/L，则该标本需进行双孔复检。复检结果中，若双孔或任意1个孔的检测结果>50 U/L，则判定该标本为ALT呈阳性；若双孔的检测结果均≤50 U/L，则判定该标本为ALT呈阴性。
将ELISA检测结果中，HBsAg、抗-HCV、抗-HIV、抗-TP及ALT检测结果呈阳性的1 962份血浆标本，所对应的用于核酸检测的血浆标本管剔除后，剩余的53 890份血浆标本均进行核酸检测。其中2016年6月至9月采集的28 199份血浆标本采用科华病毒核酸检测系统，2016年10月至12月采集的25 691份血浆标本采用诺华病毒核酸检测系统检测。核酸检测方法均采用NAT，检测项目包括，HBV DNA、HCV RNA及HIV RNA。①采用科华病毒核酸检测系统的NAT检测方法及结果判读如下。28 199份血浆标本于献血者全血标本采集次日13∶00，进行8份标本混样NAT检测，若混样池(pool)检测结果无反应性，则判定混样池中的8个标本所检测项目均呈阴性；于献血者全血采集第3天8∶00，对混样池检测结果呈反应性的标本进行拆分试验。若拆分试验检测结果呈无反应性，则该标本所检测项目判定为阴性，若拆分试验检测结果呈反应性，则该标本所检测项目判定为阳性。②采用诺华病毒核酸检测系统的检测方法和结果判读如下。25 691份血浆标本于献血者全血标本采集次日13∶00，进行单样本病毒核酸联合检测。若联合检测结果无反应性，则判定该标本HBV、HCV、HIV核酸检测结果均呈阴性；若联合检测结果呈反应性，则于献血者全血标本采集第3天8∶00，对联合检测结果呈反应性的血浆标本的HBV、HCV、HIV 3种病毒核酸进行鉴定试验。上述核酸检测的实验操作过程，严格按照试剂盒和病毒核酸检测系统的说明书进行。
对于ELISA检测结果中，HBsAg呈阴性，而NAT检测拆分试验和鉴定试验结果中，HBV DNA呈阳性的血浆标本进行HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb及HBcAb的HBV 5项病毒标志物检测。并且根据献血者血浆标本HBV五项病毒标志物的检测结果，判断该例献血者HBV的感染情况。
本研究数据采用SPSS 21.0统计学软件包进行统计学分析。血清学和核酸检测结果等计数资料采用率(%)表示。其中，标本阳性检出率(%)＝检测结果呈阳性标本数/检测标本总数×100%，有效拆分率(%)＝拆分试验检测结果呈阳性的标本所分布混样池的个数/混样检测结果呈反应性的混样池个数×100%，鉴定试验阳性检出率(%)＝鉴定试验检测结果呈阳性标本数/联合检测结果呈阳性标本数×100%。2种病毒核酸检测系统阳性检出率比较采用χ2检验；对于1≤最小理论频数<5的科华病毒核酸检测系统有效拆分率与诺华病毒核酸检验系统鉴定试验阳性检出率比较，采用连续性校正χ2检验。所有统计检验采用双侧检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。
本研究55 852份无偿献血者血浆标本中，ELISA检测结果呈阳性的血浆标本为1 962份。其中，HBsAg呈阳性为42份，抗-HCV呈阳性为12份，抗-HIV呈阳性为9份，抗-TP呈阳性为48份，ALT呈阳性为1 851份。ELISA检测结果呈阴性的53 890份血浆标本中，NAT检测结果呈阳性血浆标本为19份，占0.035%。其中，18份(0.033%)血浆标本的HBV DNA呈阳性，1份(0.002%)血浆标本的HIV RNA呈阳性。
本研究进行NAT检测的血浆标本为53 890份。其中，科华病毒核酸检测系统的血浆标本核酸阳性检出率为0.014%(4/28 199)，诺华病毒核酸检测系统的血浆标本核酸阳性检出率为0.058%(15/25 691)，二者比较，差异有统计学意义(χ2＝7.50，P<0.05)。
科华病毒核酸检测系统检出呈反应性混样池9个，经拆分试验确定4份血浆标本(分布在4个混样池)HBV DNA呈阳性，有效拆分率为44.4%(4/9)。诺华病毒核酸检测系统联合检测检出呈反应性血浆标本30份，经鉴定试验确定14份血浆标本HBV DNA呈阳性，1份血浆标本HIV RNA呈阳性，鉴定试验阳性检出率为50.0%(15/30)。科华病毒核酸检测系统有效拆分率与诺华病毒核酸检测系统鉴定试验阳性检出率比较，差异无统计学意义(χ2＝0.03，P＝0.87)。
本研究18例HBsAg ELISA检测结果呈阴性、HBV DNA NAT检测结果呈阳性的无偿献血者的HBV 5项病毒标志物检测结果显示，18例献血者存在5种血清学感染模式。其对应的无偿献血者HBV感染情况为隐匿性HBV感染占88.9%(16/18)，可疑"窗口期"HBV感染占11.1%(2/18)，见表1。
18例HBsAg ELISA检测结果呈阴性、HBV DNA NAT检测结果呈阳性的无偿献血者的HBV五项病毒标志物检测结果
18例HBsAg ELISA检测结果呈阴性、HBV DNA NAT检测结果呈阳性的无偿献血者的HBV五项病毒标志物检测结果
| 献血者HBV血清学感染模式 | 例数[例数(%)] | HBV五项病毒标志物 | 无偿献血者HBV感染情况 | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| HBsAg | HBsAb | HBeAg | HBeAb | HBcAb | |||
| 1 | 2(11.1) | － | － | － | － | － | 可疑"窗口期"感染 |
| 2 | 4(22.2) | － | ＋ | － | － | － | 隐匿性感染 |
| 3 | 5(27.8) | － | － | － | － | ＋ | 隐匿性感染 |
| 4 | 1(5.6) | － | － | － | ＋ | ＋ | 隐匿性感染 |
| 5 | 6(33.3) | － | ＋ | － | － | ＋ | 隐匿性感染 |
注：ELISA为酶联免疫吸附试验，HBV为乙型肝炎病毒，NAT为核酸扩增技术，"＋"表示该项检测结果呈阳性，"－"表示该项检测结果呈阳性
核酸检测技术可以直接检测病原体核酸，并且可以检测出标本中的微量核酸，灵敏度高。在献血者病毒感染后数天，即能采用核酸检测技术检测出血液中的病毒核酸，大大缩短检测"窗口期"，是进一步提高血液安全的重要措施之一。本研究中，53 890份ELISA检测结果呈阴性的无偿献血者血浆标本中，19份(0.035%)标本NAT检测结果呈阳性。可见在无偿献血血液筛查中，ELISA检测存在一定的漏检风险，NAT检测是对ELISA检测的有效补充。19份NAT检测结果呈阳性的血浆标本中，18份为HBV DNA呈阳性。本市2016年无偿献血者血液经HBsAg筛查后，输血传播HBV风险约为0.033%(18/53 890)，该结果高于深圳地区的0.017%[4]，稍低于广州地区的0.061%[5]和上海地区的0.060% [6]。这提示，潍坊地区无偿献血者血液进行HBsAg筛检后，经输血传播HBV的风险，仍应引起高度警惕，核酸检测技术作为血清学检测技术的补充，对进一步降低经输血传播HBV风险，保障血液安全具有重要的作用。
本研究中，科华病毒核酸检测系统和诺华病毒核酸检测系统的阳性检出率分别为0.014%和0.058%，二者比较，差异存在统计学意义(χ2＝7.50，P<0.05)。造成科华病毒核酸检测系统阳性检出率较低的原因可能包括：①科华病毒核酸检测系统为半自动化操作，实验过程中手工操作步骤较多，易造成核酸的降解；②采用的混样检测方法，降低了病毒核酸检出率，影响了NAT检测的灵敏度[7]；③病毒颗粒在血液中分布不均匀，在病毒提取过程中，可能会对部分低病毒载量的标本存在漏检。但是，亦不能排除诺华病毒核酸检测系统存在假阳性检测结果的可能。科华病毒核酸检测系统对混样检测结果呈反应性标本的有效拆分率为44.4%，与诺华病毒核酸检测系统对联合检测结果呈阳性标本的鉴定试验阳性检出率(50.0%)比较，差异无统计学意义(表2)，由此可见，2个病毒核酸检测系统对单个标本的检测能力无显著差异。
血浆标本HBsAg ELISA检测结果呈阴性，而HBV DNA NAT检测结果呈阳性的18例献血者的HBV五项病毒标志物检测结果显示，18例献血者存在5种血清学感染模式，其中隐匿性HBV感染占88.9%(16/18)，该结果与文献报道苏州地区相近[8]。2例无偿献血者血浆标本的HBV五项病毒标志物检测结果均呈阴性，该2例献血者可能存在可疑"窗口期"HBV感染。对这部分献血者需要建立合适的追踪流程进行跟踪确认HBV感染的状态，以及是否存在NAT检测假阳性的问题，但是由于献血者联系方式变更而联系不上或者与献血者不愿参与，本研究没能做进一步追踪检测。有文献报道，HBcAb呈阳性、HBsAg呈阴性的献血者可能会导致受血者感染HBV[9]。但是，目前国内血站和血液中心对无偿献血者血液的常规血清学筛查项目中，不包括HBcAb检测，而核酸检测可能筛查出这类感染病毒的献血者，从而提高了血液的安全性。
本研究中，ELISA检测结果呈阴性，而NAT检测结果呈阳性标本为19份，其中18份(0.033%)HBV DNA呈阳性，1份HIV RNA呈阳性(0.002%)。诺华病毒核酸检测系统对联合检测结果呈阳性标本的鉴定试验阳性检出率为50.0%，低于曾劲峰等报道的68.4%[10]。诺华病毒核酸检测系统鉴定试验阳性检出率较低的原因可能有，联合检测存在假阳性结果，或者鉴定试验时存在漏检现象，以及对于低病毒含量标本的检测重复性较差等。因此，对血液标本鉴定试验结果呈阴性的献血者应进行追踪检测，确认献血者是否处于感染状态非常有必要，这也是下一步研究的方向。
无
