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中国南方汉族造血干细胞捐献者HLA-A、-B、-C、-DRB1及-DQB1高分辨等位基因多态性分析
国际输血及血液学杂志, 2018,41(6) : 497-505. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1673-419X.2018.06.007
摘要
目的

探讨中国南方汉族造血干细胞捐献者人类白细胞抗原(HLA)-A、-B、-C、-DRB1及-DQB1位点高分辨等位基因的多态性分布。

方法

选择2016年1月至2017年12月于中国造血干细胞捐献者资料库(CMDP)深圳分库登记的4 262例中国南方汉族造血干细胞捐献者为研究对象。采用PCR-序列特异性寡核苷酸探针(SSO)和二代测序(NGS)技术对本研究4 262例造血干细胞捐献者的HLA-A、-B、-C、-DRB1及-DQB1位点进行高分辨等位基因分型检测。采用直接计数法分别计算上述5个HLA位点的常见、确认及罕见等位基因频率。采用χ2检验判断研究对象的HLA-A、-B、-C、-DRB1及-DQB1各位点等位基因的分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。

结果

①本研究4 262例中国南方汉族造血干细胞捐献者的HLA-A、-B、-C、-DRB1及-DQB1位点等位基因观察值与期望值分别比较，差异均无统计学意义(χ2＝295.068、572.482、355.205、362.584、312.150，P>0.05)。本研究4 262例造血干细胞捐献者的HLA-A、-B、-C、-DRB1及-DQBl位点基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律。②本研究4 262例中国南方汉族造血干细胞捐献者中，检出的HLA-A、-B、-C、-DRB1及-DQB1位点的等位基因分别为49、97、37、48和22种，其中等位基因频率>0.05的常见等位基因包括：HLA-A*11∶01、24∶02、02∶07、02∶01、33∶03和02∶03，累计等位基因频率为0.767 1；HLA-B*40∶01、46∶01、58∶01、13∶01和51∶01，累计等位基因频率为0.471 6；HLA-C*01∶02、07∶02、03∶04、08∶01、03∶02、06∶02和03∶03，累计等位基因频率为0.782 5；HLA-DRB1*09∶01、15∶01、12∶02、07∶01、08∶03、03∶01、11∶01和04∶05，累计等位基因频率为0.656 4；以及HLA-DQB1*03∶01、03∶03、06∶01、05∶02、03∶02、02∶01、05∶03、06∶02和02∶02，累计等位基因频率为0.877 6。③本研究4 262例中国南方汉族造血干细胞捐献者中，HLA-A、-B、-C、-DRB1及-DQB1位点的确认及罕见等位基因分别检出22、42、14、11和7种，其中HLA-A*29∶03，HLA-B*18∶04、15∶296和54∶03，HLA-C*12∶12、HLA-DRB1*04∶101，以及HLA-DQB1*02∶10为罕见等位基因，目前尚未被收录于CMDP的《常见及确认等位基因表(CWD)》2.3版本。

结论

本研究获得较为完整的中国南方汉族造血干细胞捐献者的HLA-A、-B、-C、-DRB1及-DQB1位点的高分辨等位基因多态性分布数据，记录并统计HLA确认及罕见等位基因。本研究结果有助于CMDP中HLA基因人群分布和多态性数据的积累，并且为完善CMDP的CWD提供参考依据。

引用本文: 全湛柔, 邓志辉, 周丹, 等.  中国南方汉族造血干细胞捐献者HLA-A、-B、-C、-DRB1及-DQB1高分辨等位基因多态性分析 [J] . 国际输血及血液学杂志, 2018, 41(6) : 497-505. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1673-419X.2018.06.007.
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造血干细胞与器官移植是治疗血液系统恶性疾病及实体肿瘤等人类重大疾病的有效手段，而在移植过程中，供、受者之间的人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)匹配程度，是决定移植排斥反应严重程度的重要因素[1]。在进行造血干细胞和器官移植时，供者和受者之间HLA匹配程度越高，排斥反应的发生率就越低，移植成功率和移植器官长期存活率就越高；反之，则越容易发生排斥反应。HLA基因系统表现出迄今所知人类基因组中最为复杂的遗传学多态性，HLA基因位于人类染色体6p21.31，长约3 600 kb。根据功能和产物结构的不同，HLA基因可分为3组：经典HLA基因、免疫功能相关基因和免疫无关基因，其中经典HLA基因主要包括HLA-A、-B、-C、-DRB1及-DQB1，这5种经典HLA基因与输血和急性移植物抗宿主病密切关联[1,2,3]。因此，对于经典的HLA基因进行分型具有重要的临床意义。

2007年，美国组织相容性和免疫遗传协会(American Society for Histocompatibility and Immunogenetics，ASHI)制定《常见及确认的等位基因表(Common and Well-documented Alleles，CWD)》[4]，为临床HLA高分辨分型检测及实验室评估提供了参考依据。2012年，中国造血干细胞捐献者资料库(China Marrow Donor Program，CMDP)根据国内具体情况和中国人群的HLA遗传学数据，提出了适合国内HLA分型指导的CMDP的CWD，该表截至2018年已更新至2.3版本。目前，CMDP的HLA分型资料获得主要采用PCR-序列特异性寡核苷酸探针(sequence-specific oligonudeotide，SSO)和PCR-直接测序分型(sequence-based typing，SBT)方法，其中PCR-SBT方法是目前世界卫生组织(World Health Organization，WHO)推荐的HLA分型方法的"金标准"[5]。随着HLA高分辨分型数据登记入CMDP，已有文献相继报道中国人群HLA-A、-B、-C及-DRB1和-DQB1位点的多态性分布[6,7]。HLA基因多态性不仅表现在基因座上存在众多的复等位基因，而且这些复等位基因在不同民族、地区和人种的分布亦不同。Hosomichi等[8]研究结果显示，在HLA分型的研究中，由于HLA基因的复杂性，经典的PCR-SBT测序方法不能全面地阐明HLA基因的基因组组成，以及其进化机制；而基于二代测序(next-generation sequencing，NGS)技术的HLA分型研究保证了HLA基因测序的完整性，并且有望提高对HLA基因调控机制的理解，包括转录，调控表达和表观遗传学等。国内外已有文献报道，NGS技术在HLA分型检测的应用[9,10]。因此，本研究采用PCR-SSO和基于Illumina Miseq测序仪的NGS技术对4 262例中国南方汉族造血干细胞捐献者的HLA-A、-B、-C、-DRB1及-DQB1进行分型检测，并且分析中国南方汉族人群HLA-A、-B、-C、-DRB1及-DQB1的多态性分布，旨在为人类学，器官及造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation, HSCT)和疾病相关性研究，以及CMDP的CWD的补充、修订提供参考数据。现将研究结果报道如下。

1　资料与方法
1.1　研究对象

选择2016年1月至2017年12月于CMDP深圳分库登记的4 262例中国南方汉族造血干细胞捐献者为研究对象。造血干细胞捐献者的年龄为18～60岁；男性捐献者为2 218例，女性为2 044例。研究对象纳入标准：①造血干细胞志愿捐献者自述的籍贯地理位置为中国南方，②民族为汉族，③无亲缘关系，④均签署《中国造血干细胞捐献者资料库志愿捐献者同意书》。排除标准：不愿参与本研究者。

1.2　方法
1.2.1　主要试剂和仪器

全自动核酸提取试剂(批号：SM-001-16033001，中国台湾芮宝公司)；LABType™ SSO HLA-A、-B、-C、-DRB1及-DQB1位点流式磁珠分型试剂(批号：A*Lot 002、B*Lot 004、C*Lot 001、DRB1*Lot 004、DQB1*Lot 011，美国One Lambda公司)；NGSgo®-HLA-A、-B、-C、-DRB1及-DQB1分型试剂盒(批号：Lot 002，北京诺诗康瀛医学科技有限公司)；Kapa二代测序文库定量试剂盒(批号：Lot 002，北京诺诗康瀛医学科技有限公司)；Illumina Miseq Reagent Kit V3(600 cycles)(批号：Lot 002，北京诺诗康瀛医学科技有限公司)。MagCore HF16型全自动核酸提取仪(中国台湾芮宝公司)，ND 2000型超微量紫外分光光度计(美国Thermo Fisher Scientific公司)，FLEXMAP-3D型多功能高通量流式荧光点阵仪(美国One Lambda公司)，Bioruptor Pico型超声破碎仪(比利时Bioruptor公司)，Veriti 96型基因扩增仪、9700型基因扩增仪(美国ABI公司)；Illumina Miseq测序仪(美国Illumina公司)。

1.2.2　基因组DNA提取

于造血干细胞捐献前，抽取造血干细胞捐献者肘静脉全血5 mL，置于乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)-K2抗凝管，上、下颠倒混匀后；分别吸取200 μL，采用全自动核酸提取试剂和MagCore HF16型全自动核酸提取仪，提取基因组DNA，调整基因组DNA浓度为20～50 ng/μL，纯度为1.65～1.80。

1.2.3　采用PCR-SSO法对HLA分型的方法及结果判读

根据美国One Lambda公司LABTypeTM SSO ClassⅠA/B/C，ClassⅡDRB1/DQB1分型试剂盒说明书进行HLA-A、-B、-C、-DRB1及-DQB1等位基因位点扩增。按照引物2.0 μL，引物缓冲液8.0 μL，HLA-A、-B、-C Taq聚合酶0.1 μL或HLA-DRB1、-DQB1 Taq聚合酶0.07 μL的比例配置扩增混合液。每孔加入的上述扩增混合液9.0 μL及基因组DNA 2.0 μL。扩增程序为：96 ℃ 3 min；96 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，5个循环；96 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，30个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。扩增结束后，将3.0 μL扩增产物与1.1 μL负载染料和1.1 μL荧光液混匀后，采用2.0%琼脂糖凝胶电泳。若电泳结果中，HLA-A、-B和-C基因的PCR扩增产物出现2条明亮电泳条带，HLA-DRB1和-DQB1基因的PCR扩增产物出现1条明亮电泳条带，则证明扩增成功。扩增成功的PCR扩增产物经杂交及荧光标记后，采用FLEXMAP-3D型多功能高通量流式荧光点阵仪进行HLA分型，分型结果采用HLA Fushion v4.1软件(美国One Lambda公司)进行分析。分型结果中，常见等位基因(common alleles)、确认等位基因(well-documented alleles)及罕见等位基因(rare alleles)的判定方法参照文献[11]。

1.2.4　采用NGS法对HLA分型的方法

收集PCR-SSO法检测获得的HLA确认及罕见等位基因，以及模棱两可结果标本，采用北京诺诗康瀛医学科技有限公司的NGSgo®-HLA-A、-B、-C、-DRB1及-DQB1分型试剂盒进行HLA分型检测。按照试剂盒说明进行等位基因特异性扩增，将同一标本的HLA-A、-B、-C、-DRB1及-DQB1的PCR产物等摩尔混合后，利用超声破碎仪将PCR产物打断成长度为300～800 bp的DNA片段。按照试剂盒说明书进行文库构建，按照Kapa二代测序文库定量试剂盒说明书对文库浓度进行鉴定。吸取4 nmol/L样品变性，利用Illumina Miseq Reagent Kit V3(600 cycles)检测并读取数据。将读取的数据导入TypeStream Visual™ NGS分析软件1.2(美国Thermo Fisher Scientific公司)进行结果分析。具体操作步骤参见文献[12]。

1.3　统计学分析方法

本研究数据采用Arlequin 3.5软件进行统计学分析。采用直接计算法统计HLA-A、-B、-C、-DRB1及-DQB1的常见等位基因、确认等位基因，以及罕见等位基因的基因频率。等位基因频率计算公式为：等位基因频率＝(该基因杂合子例数＋该基因纯合子例数×2)/(总例数×2)。采用χ2检验判断研究对象的HLA-A、-B、-C、-DRB1及-DQB1各位点等位基因的分布是否符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，以P>0.05表示分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。本研究所有统计检验均采用双侧检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2　结果
2.1　HLA-A、-B、-C、-DRB1及-DQB1位点Hardy-Weinberg平衡检验

本研究4 262例造血干细胞捐献者的HLA-A、-B、-C、-DRB1及-DQB1位点等位基因观察值与期望值比较，差异无统计学意义(χ2＝295.068、572.482、355.205、362.584、312.150，P>0.05)。本研究4 262例造血干细胞捐献者的HLA-A、-B、-C、-DRB1及-DQBl位点基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律，表明本研究研究对象选择具有代表性。

2.2　HLA-A、-B及-C等位基因频率分布

本研究4 262例造血干细胞捐献者中，共检出49种HLA-A等位基因，其中等位基因频率>0.05的常见等位基因包括：HLA-A*11∶01、24∶02、02∶07、02∶01、33∶03和02∶03，其累计等位基因频率为0.767 1；97种HLA-B等位基因中，等位基因频率>0.05的常见等位基因包括：HLA-B*40∶01、46∶01、58∶01、13∶01和51∶01，其累计等位基因频率为0.471 6；37种HLA-C等位基因中，等位基因频率>0.05的常见等位基因包括：HLA-C*01∶02、07∶02、03∶04、08∶01、03∶02、06∶02和03∶03，其累计等位基因频率为0.782 5。本研究4 262例造血干细胞捐献者的HLA-A、-B及-C等位基因频率分布，见表1，表2，表3。

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表1

本研究4 262例造血干细胞捐献者的HLA-A等位基因频率分布

表1

本研究4 262例造血干细胞捐献者的HLA-A等位基因频率分布

HLA-A等位基因检出等位基因例数等位基因频率HLA-A等位基因检出等位基因例数等位基因频率HLA-A等位基因检出等位基因例数等位基因频率
01∶011580.018 511∶01a2 2160.260 029∶0240.000 5
01∶0320.000 211∶022470.029 029∶0310.000 1
02∶01a8300.097 411∶0340.000 530∶013320.038 9
02∶03a4730.055 511∶6010.000 130∶0240.000 5
02∶05160.001 923∶01130.001 530∶0450.000 6
02∶063120.036 624∶02a1 2520.146 931∶012260.026 5
02∶07a9620.112 924∶0340.000 532∶01820.009 6
02∶0910.000 124∶0420.000 233∶0170.000 8
02∶10190.002 224∶07160.001 933∶03a8050.094 4
02∶53N10.000 124∶0810.000 134∶0160.000 7
02∶9010.000 124∶10140.001 666∶0140.000 5
02∶10810.000 124∶20200.002 368∶01410.004 8
02∶11610.000 124∶6410.000 169∶0140.000 5
02∶41910.000 125∶0120.000 274∶0170.000 8
02∶44610.000 126∶012100.024 674∶0510.000 1
03∶011390.016 326∶1810.000 1   
03∶02140.001 629∶01590.006 9   

注：a表示等位基因频率>0.05的常见等位基因。HLA为人类白细胞抗原

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表2

本研究4 262例中国南方汉族造血干细胞捐献者的HLA-B等位基因频率分布

表2

本研究4 262例中国南方汉族造血干细胞捐献者的HLA-B等位基因频率分布

HLA-B等位基因检出等位基因例数等位基因频率HLA-B等位基因检出等位基因例数等位基因频率HLA-A等位基因检出等位基因例数等位基因频率
07∶02940.011 027∶0210.000 146∶01a1 1430.134 1
07∶05530.006 227∶041080.012 748∶011310.015 4
07∶4810.000 127∶05490.005 748∶03140.001 6
08∶01400.004 727∶0670.000 849∶0160.000 7
13∶01a5540.065 027∶07100.001 250∶01280.003 3
13∶023710.043 527∶1510.000 151∶01a4460.052 3
13∶2510.000 127∶2430.000 451∶02890.010 4
14∶0130.000 427∶2510.000 151∶0620.000 2
14∶0290.001 135∶011840.021 651∶0730.000 4
15∶013570.041 935∶0260.000 751∶0810.000 1
15∶023930.046 135∶03700.008 252∶011510.017 7
15∶0330.000 435∶05270.003 253∶0110.000 1
15∶05130.001 535∶0860.000 754∶012830.033 2
15∶07160.001 935∶3010.000 154∶0310.000 1
15∶111030.012 137∶01820.009 655∶0190.001 1
15∶12230.002 738∶01250.002 955∶022570.030 2
15∶1340.000 538∶022970.034 855∶0430.000 4
15∶17100.001 239∶011610.018 955∶0730.000 4
15∶18410.004 839∶05250.002 955∶1240.000 5
15∶1960.000 739∶0940.000 555∶2110.000 1
15∶2120.000 239∶2410.000 156∶01700.008 2
15∶25470.005 540∶01a1 1940.140 156∶03110.001 3
15∶27630.007 440∶021280.015 056∶04130.001 5
15∶2910.000 140∶03160.001 956∶1010.000 1
15∶29610.000 140∶061850.021 756∶1810.000 1
15∶3260.000 740∶4010.000 157∶01540.006 3
15∶3520.000 240∶5510.000 158∶01a6830.080 1
15∶3910.000 141∶0170.000 859∶0140.000 5
15∶4650.000 644∶02440.005 267∶01400.004 7
15∶5830.000 444∶031560.018 373∶0110.000 1
18∶01210.002 544∶0510.000 181∶0180.000 9
18∶0260.000 744∶11810.000 1   
18∶0410.000 145∶0150.000 6   

注：a表示等位基因频率>0.05的常见等位基因。HLA为人类白细胞抗原

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表3

本研究4 262例中国南方汉族造血干细胞捐献者的HLA-C等位基因频率分布

表3

本研究4 262例中国南方汉族造血干细胞捐献者的HLA-C等位基因频率分布

HLA-C等位基因检出等位基因例数等位基因频率HLA-C等位基因检出等位基因例数等位基因频率HLA-C等位基因检出等位基因例数等位基因频率
01∶02a1 7670.207 305∶01420.004 912∶031640.019 2
01∶03250.002 906∶02a5240.061 512∶1210.000 1
01∶0650.000 607∶01660.007 714∶023580.042 0
01∶0840.000 507∶02a1 6750.196 514∶03490.005 7
02∶02380.004 507∶04560.006 614∶2910.000 1
03∶02a6060.071 107∶2710.000 115∶022180.025 6
03∶03a4450.052 207∶6310.000 115∶05360.004 2
03∶04a9490.111 307∶6610.000 115∶1710.000 1
03∶10010.000 108∶01a7040.082 616∶0280.000 9
03∶1710.000 108∶02130.001 516∶0440.000 5
04∶014010.047 008∶03360.004 217∶0140.000 5
04∶03890.010 408∶2710.000 1   
04∶0610.000 112∶022280.026 7   

注：a表示等位基因频率>0.05的常见等位基因。HLA为人类白细胞抗原

2.3　本研究4 262例造血干细胞捐献者的HLA-DRB1、-DQB1等位基因频率分布

本研究4 262例造血干细胞捐献者中，HLA-DRB1、-DQB1等位基因分别检出48、22种，其中等位基因频率>0.05的常见等位基因包括：HLA-DRB1*09∶01、15∶01、12∶02、07∶01、08∶03、03∶01、11∶01和04∶05，其累计等位基因频率为0.656 4，以及HLA-DQB1*03∶01、03∶03、06∶01、05∶02、03∶02、02∶01、05∶03、06∶02和02∶02，其累计等位基因频率为0.877 6。本研究4 262例造血干细胞捐献者的HLA-DRB1及-DQB1等位基因频率分布，见表4，表5。

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表4

本研究4 262例中国南方汉族造血干细胞捐献者的HLA-DRB1等位基因频率分布

表4

本研究4 262例中国南方汉族造血干细胞捐献者的HLA-DRB1等位基因频率分布

HLA-DRB1等位基因检出等位基因例数等位基因频率HLA-DRB1等位基因检出等位基因例数等位基因频率HLA-DRB1等位基因检出等位基因例数等位基因频率
01∶011150.013 508∶02450.005 313∶0520.000 2
01∶02120.001 408∶03a5470.064 213∶0720.000 2
03∶01a5080.059 608∶0410.000 113∶12860.010 1
03∶1510.000 108∶09150.001 814∶01G3540.041 5
04∶01510.006 009∶01a1 2960.152 014∶03250.002 9
04∶0280.000 910∶011130.013 314∶04540.006 3
04∶031920.022 511∶01a4920.057 714∶052030.023 8
04∶04670.007 911∶0320.000 214∶0610.000 1
04∶05a4500.052 811∶04200.002 314∶07190.002 2
04∶062190.025 711∶0660.000 714∶1230.000 4
04∶07110.001 311∶5710.000 114∶1890.001 1
04∶0840.000 512∶01G2720.031 915∶01a9530.111 8
04∶10210.002 512∶02a7870.092 315∶022460.028 9
04∶10110.000 113∶01930.010 915∶0480.000 9
07∶01a5630.066 013∶022550.029 916∶01100.001 2
08∶0110.000 113∶0330.000 416∶023770.044 2

注：a表示等位基因频率>0.05的常见等位基因。HLA为人类白细胞抗原

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表5

本研究4 262例中国南方汉族造血干细胞捐献者的HLA-DQB1等位基因频率分布

表5

本研究4 262例中国南方汉族造血干细胞捐献者的HLA-DQB1等位基因频率分布

HLA-DQB1等位基因检出等位基因例数等位基因频率HLA-DQB1等位基因检出等位基因例数等位基因频率HLA-DQB1等位基因检出等位基因例数等位基因频率
02∶01a5220.061 203∶1340.000 506∶01a9290.109 0
02∶02a4550.053 404∶013530.041 406∶02a4620.054 2
02∶1010.000 104∶02670.007 906∶03900.010 6
03∶01a1 8710.219 505∶012970.034 806∶04940.011 0
03∶02a5880.069 005∶02a8460.099 206∶0710.000 1
03∶03a1 3410.157 305∶03a4670.054 806∶091280.015 0
03∶0410.000 105∶0410.000 106∶1050.000 6
03∶0510.000 1      

注：a表示等位基因频率>0.05的常见等位基因。HLA为人类白细胞抗原

2.4　本研究4 262例造血干细胞捐献者的确认等位基因和罕见等位基因频率分布

本研究4 262例造血干细胞捐献者中，HLA-A、-B、-C、-DRB1及-DQB1确认和罕见等位基因分别检出22、42、14、11和7种，其累计基因频率分别为0.005 9、0.013 5、0.002 6、0.003 0和0.001 6，其中HLA-A*29∶03，HLA-B*18∶04、15∶296和54∶03，HLA-C*12∶12，HLA-DRB1*04∶101和HLA-DQB1*02∶10为罕见等位基因，目前尚未被收录入CMDP的CWD 2.3版本。本研究4 262例中国南方汉族造血干细胞捐献者的HLA-A、-B、-C、-DRB1及-DQB1确认和罕见等位基因频率分布表，见表6。

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表6

本研究4 262例中国南方汉族造血干细胞捐献者的HLA-A、-B、-C、-DRB1及-DQB1确认和罕见等位基因频率分布

表6

本研究4 262例中国南方汉族造血干细胞捐献者的HLA-A、-B、-C、-DRB1及-DQB1确认和罕见等位基因频率分布

HLA等位基因检出等位基因例数等位基因频率HLA等位基因检出等位基因例数等位基因频率HLA等位基因检出等位基因例数等位基因频率
HLA-A   18∶0260.000 7 01∶0840.000 5
 01∶0320.000 2 18∶04a10.000 1 03∶0430.000 4
 02∶0910.000 1 27∶0210.000 1 03∶10010.000 1
 02∶41910.000 1 27∶0670.000 8 03∶1710.000 1
 02∶44610.000 1 27∶1510.000 1 04∶0610.000 1
 02∶53N10.000 1 27∶2430.000 4 07∶2710.000 1
 02∶9010.000 1 27∶2510.000 1 07∶6310.000 1
 24∶0420.000 2 35∶3010.000 1 07∶6610.000 1
 24∶0810.000 1 39∶0940.000 5 08∶2710.000 1
 24∶10140.001 6 56∶03110.001 3 12∶12a10.000 1
 24∶6410.000 1 15∶296a10.000 1 14∶2910.000 1
 30∶0450.000 6 15∶3910.000 1 15∶1710.000 1
 02∶10810.000 1 39∶2410.000 1 16∶0410.000 1
 02∶11610.000 1 40∶4010.000 1HLA-DRB1  
 11∶6010.000 1 40∶5510.000 1 08∶0110.000 1
 25∶0120.000 2 44∶0510.000 1 11∶0320.000 2
 26∶1810.000 1 44∶11810.000 1 11∶5710.000 1
 29∶0240.000 5 51∶0620.000 2 13∶0720.000 2
 29∶03a10.000 1 51∶0730.000 4 14∶1890.001 1
 34∶0160.000 7 51∶0810.000 1 04∶101a10.000 1
 66∶0140.000 5 53∶0110.000 1 08∶0410.000 1
 74∶0110.000 1 54∶03a10.000 1 13∶0330.000 4
 74∶0510.000 1 55∶0430.000 4 13∶0520.000 2
HLA-B   55∶0730.000 4 14∶0610.000 1
 07∶4810.000 1 55∶1240.000 5 14∶1230.000 4
 13∶2510.000 1 55∶2110.000 1HLA-DQB1  
 15∶0320.000 2 56∶04130.001 5 03∶0410.000 1
 15∶1340.000 5 56∶1010.000 1 03∶0510.000 1
 15∶1960.000 7 56∶1810.000 1 03∶1340.000 5
 15∶2120.000 2 59∶0140.000 5 02∶10a10.000 1
 15∶2910.000 1 73∶0110.000 1 05∶0410.000 1
 15∶3520.000 2 81∶0180.000 9 06∶0710.000 1
 15∶4650.000 6HLA-C   06∶1050.000 6
 15∶5830.000 4 01∶0650.000 6    

注：a为未被CMDP的CWD 2.3版本收录的HLA罕见等位基因。HLA为人类白细胞抗原

3　讨论

HLA是一组由一列紧密连锁的基因座组成的具有高度多态性的遗传复合体，其在器官移植和HSCT，以及许多疾病如强直性疾病脊柱炎[13]和类风湿性关节炎[14]的诊断和预后中发挥作用。HLA高分辨分型对匹配无关HSCT供者[15]亦非常重要。随着DNA测序技术的发展，越来越多的HLA等位基因被发现。

本研究4 262例中国南方汉族造血干细胞捐献者中HLA-A、-B、-C、-DRB1及-DQB1高分辨等位基因分别检出49、97、37、48及22种，其中等位基因频率>0.05的常见等位基因包括：HLA-A*11∶01、24∶02、02∶07、02∶01、33∶03和02∶03，其累计等位基因频率为0.767 1；HLA-B*40∶01、46∶01、58∶01、13∶01和51∶01，其累计等位基因频率为0.471 6；HLA-C*01∶02、07∶02、03∶04、08∶01、03∶02、06∶02和03∶03，其累计等位基因频率为0.782 5; HLA-DRB1*09∶01、15∶01、12∶02、07∶01、08∶03、03∶01、11∶01和04∶05，其累计等位基因频率为0.656 4;以及HLA-DQB1*03∶01、03∶03、06∶01、05∶02、03∶02、02∶01、05∶03、06∶02和02∶02，其累计等位基因频率为0.877 6(表1，表2，表3，表4，表5)。HLA-A、-B及-DRB1高分辨等位基因多态性分布特征与中国北方汉族造血干细胞捐献者[16]和中国南方汉族人群HLA-Ⅰ、-Ⅱ类等位基因[17]多态性分布，存在相似之处，亦与苏湘晖等[6]报道的岳阳地区汉族人群HLA-A、-B、-C、-DRB1及-DQB1高分辨等位基因多态性分布特征相似，这说明CMDP深圳分库HLA-A、-B、-DRB1高分辨等位基因多态性既有北方汉族人群的多态性特征，也有南方汉族人群的多态性特征。HLA-C高分辨等位基因的多态性分布特征与黑爱莲等[7]的研究结果相近，但与孙昂等[18]报道的岳阳地区汉族人群HLA-C等位基因的分布规律存在差异。4 262例中国南方汉族造血干细胞捐献者的HLA-C*06∶02基因频率为0.061 5(表3)，高于岳阳地区汉族人群该基因频率的0.038 9[18]，该差异可能与研究样本量大小、研究对象区域性不同有关，亦可说明不同地区人群HLA-C等位基因分布具有其自身特点。本研究HLA-DQB1高分辨等位基因多态性分布特征与中国南方汉族人群HLA-Ⅱ类等位基因多态性研究结果[17]相近，与洪忻等[19]报道的江苏省汉族人群的HLA-DQB1等位基因多态性的分布存在差异，这可能与区域的局限性使HLA基因的部分基因型的等位基因频率较高，从而对遗传多样性产生影响。由此可见，HLA等位基因在不同群体中的分布具有特异性。而临床研究表明，HSCT中供、受者之间HLA等位基因的匹配程度越高，移植后疗效越好[20]。因此了解群体HIA等位基因多态性分布特征，有利于寻找特定HLA等位基因相合的HSCT供者。HLA等位基因多态性分布数据为需HSCT的血液系统恶性疾病患者寻找HLA等位基因匹配供者提供了直接的参考，为临床医师选择供者提供了依据。

本研究采用PCR-SSO的方法进行HLA分型检测，对于所产生的确认及罕见等位基因以及模棱两可结果，进一步采用NGS技术进行分型。本研究4 262例中国南方汉族造血干细胞捐献者HLA-A、-B、-C、-DRB1及-DQB1位点的确认和罕见等位基因分别检出22、42、14、11和7种，其中HLA-A*29∶03，HLA-B*18∶04、15∶296和54∶03，HLA-C*12∶12、HLA-DRB1*04∶101、HLA-DQB1*02∶10为罕见等位基因，目前尚未被收录于CMDP的CWD 2.3版本(表6)。对比ASHI公布的CWD 2.0版本，以及CMDP的CWD 2.3版本，发现HLA-A*01∶03、02∶09、02∶53N、24∶10、30∶04、25∶01、29∶02、66∶01和74∶01，HLA-B*15∶03、15∶13、15∶21、15∶35、18∶02、27∶02、27∶06、15∶39、39∶24、44∶05、51∶06、51∶07、51∶08、53∶01、59∶01、73∶01和81∶01，HLA-C*16∶04，HLA-DRB1*08∶01、11∶03、14∶18、08∶04、13∶03、13∶05和14∶06，以及HLA-DQB1*03∶04、03∶05和05∶04，在高加索人群中为常见等位基因，而在中国人群中为确认等位基因；HLA-A*02∶419、02∶446、02∶90、02∶108、02∶116和11∶60，HLA-B*07∶48、13∶25、15∶19、27∶25、40∶55、44∶118、55∶21和56∶18，HLA-C*03∶100、07∶63、08∶27、14∶29和15∶17，HLA-DRB1*11∶57，以及HLA-DQB1*06∶07在中国人群中为确认等位基因，而在高加索人群为罕见等位基因，尚未被收录于ASHI的CWD 2.0版本中；HLA-B*18∶04和HLA-C*12∶12在高加索人群中为确认等位基因，而在中国人群中为罕见等位基因，尚未被收录于CMDP的CWD 2.3版本；HLA-A*29∶03、HLA-B*15∶296、54∶03, HLA-DRB1*04∶101，以及HLA-DQB1*02∶10在2个人群中均为罕见等位基因，均未被收录于ASHI的CWD 2.0版本和CMDP的CWD 2.3版本。确认和罕见等位基因的共同特点为在整个人群大样本中的比例<0.005，并且在既往中国汉族人群HLA分型中，未被报道的基因型。HLA确认和罕见等位基因的发现，对丰富中国南方汉族人群基因多样性数据，提高HLA实验室疑难标本分型技术，制定针对中国人群的CWD和HLA罕见等位基因表意义明显。

2001年以来，CMDP采用PCR-SSP技术对HLA-A、-B及-DRB1进行分型，由于受到技术本身限制，获取的数据以低分辨为主，并不能确保造血干细胞供者和受者的HLA准确匹配，患者通常需要和多个HLA低分辨匹配的志愿者进行HLA高分辨复核，才能找到HLA准确匹配的供者。因此，HLA高分辨结果录入CMDP对提高HLA配型效率很重要。随着HLA分型技术的发展，PCR-SSO技术被广泛应用于造血干细胞供、受者的HLA分型。PCR-SSO是根据探针与靶序列有无结合判定目的基因型别的一种技术方法，该方法操作虽然简便，但是由于受到技术本身的精确度限制，检出模棱两可结果较多，仅靠此方法无法满足HLA高分辨结果录入CMDP的标准。当PCR-SBT法检测结果的模棱两可的等位基因组合中出现CWD等位基因时，需要进一步区分。根据CWD表排除罕见等位基因组合外，还需要增加PCR-SBT法或者序列特异性引物实验才能获得可靠的HLA高分辨结果。NGS技术通过扩增和测序整个HLA基因座，对PCR-SBT法中没有扩增的其他外显子进行深度测序，显著减少了相位相关问题，并且可以检测出所有可能的基因多态性，从而更好地确定等位基因的类型，补充数据库中缺失的外显子序列，帮助更好地理解所有外显子的生物学活性和功能，最大限度地避免了模棱两可数据的出现[21,22,23]。

综上所述，采用PCR-SSO和NGS法联合应用能更加精确地分析HLA等位基因多态性分布特征，并且进一步获得较为完整的HLA确认及罕见等位基因资料。这对人类学、器官移植、HSCT和疾病相关性研究，以及CWD的补充修订提供参考数据，均有重要意义。

利益冲突
利益冲突

无

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HLA抗原
等位基因
基因频率
聚合酶链反应
高分辨基因分型
常见等位基因
确认等位基因
罕见等位基因
聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸探针
二代测序