目前，异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)已被越来越广泛地应用于血液系统疾病及恶性实体肿瘤等的治疗。但患者接受allo-HSCT后亦存在一系列问题，如原发病复发、移植物排斥(GR)、移植物抗宿主病(GVHD)等，这可能导致移植失败，亦是目前影响allo-HSCT疗效的重要难题。动态监测供、受者不同免疫细胞亚群的嵌合状态，并且及时作出相应的临床处理，对减少疾病复发和GR，降低GVHD发生风险有重要意义。其中，T细胞的嵌合状态与移植后GVHD发生相关，患者移植早期的T细胞嵌合率越高，则越容易发生GVHD；B细胞的嵌合状态通常与allo-HSCT后复发有相关性。笔者主要就不同免疫细胞亚群嵌合率的监测，结合影响嵌合状态的因素，对动态监测嵌合率在allo-HSCT后的临床意义进行综述，从而进一步指导临床治疗和干预。
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异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)是诸多血液系统疾病的重要治疗手段，使越来越多血液系统疾病患者及部分恶性实体肿瘤患者获得长期生存，甚至达到治愈。但allo-HSCT后出现的原发疾病复发，移植物排斥(graft rejection，GR)，移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)等问题常与供、受者造血与免疫系统的嵌合状态相关，同时也成为导致allo-HSCT失败的主要原因。因此，对不同免疫细胞亚群早期嵌合状态的监测，以及对影响嵌合率的主要因素进行分析，并据此尽早进行临床干预，对减少原发病复发、GR和降低GVHD发生率具有重要的意义。目前，嵌合分析(chimerism analysis，CA)已成为围移植期监测的重要工具之一。由于不同免疫细胞亚群的生物学特性存在差异，在评估allo-HSCT后相关临床事件的敏感度和特异度亦有差异，因此对allo-HSCT后不同免疫细胞亚群嵌合率进行监测，并以此指导临床干预和治疗具有重要意义。本文主要从不同免疫细胞亚群嵌合率的监测，结合影响嵌合状态的因素，对动态监测嵌合率在allo-HSCT后的临床意义进行综述，从而进一步指导临床治疗和干预。
嵌合率是指allo-HSCT后受者体内供者细胞所占百分率，可直接反映供者细胞在受者体内的嵌合状态，亦称为供者细胞嵌合率(donor chimerism，DC)。嵌合状态是指在受者行allo-HSCT后，供者来源造血干细胞植入受者体内，供、受者双方造血细胞达到共存的现象[1]。嵌合状态目前可分为完全供者嵌合状态(full donor chimerism，FDC)和混合嵌合状态(mixed chimerism，MC)。FDC是指当供者细胞完全占据受者的骨髓或外周血，即供者细胞完全植入(DC≥95%)；若移植后受者细胞仍出现在其骨髓或外周血中，可以同时检测到供者和受者来源的2种细胞成分，称为MC(5%≤DC<95%)。MC又可划分为短暂MC、稳定MC和不稳定MC。短暂MC为allo-HSCT后出现的一过性MC，之后MC转化为FDC，即受者细胞在骨髓或外周血中消失；稳定MC为5%≤DC<95%，并且供者细胞比例长期保持恒定；不稳定MC为移植后短期受者细胞比例增加，之后DC逐渐下降至90%以下[2]。而DC<5%则定义为完全受者嵌合状态。随着DNA检测技术灵敏度不断提高，嵌合体概念的界定标准亦在不断更新。有学者提出，以2.5%<DC<97.5%为标准界定嵌合体，并且把DC<1%定义为微嵌合体(micro chimerism，Mc)。
嵌合率的传统检测方法包括性染色体的荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)，数目可变串联重复序列(variable numbers of tandem repeat，VNTR)检测，限制性片断长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)检测，人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)/红细胞抗原检测，以及实时定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction，RQ-PCR)等，但这些方法不同程度地存在性别限制、灵敏度低、样本需要量大、操作复杂、费时长等局限。目前，嵌合率检测方法已由传统的细胞学和遗传学方法发展到分子生物学方法，其中短串联重复序列(short tandem repeat，STR)-PCR技术被认为是目前检测移植嵌合状态最灵敏的方法之一[3,4]。该技术具有灵敏度高，重复性好，操作简单，不受性别限制，检测结果不受样本中细胞数量的影响，可同时对allo-HSCT前、后样本进行PCR、电泳及数据分析等优势，已成为目前国际骨髓移植登记处(International Bone Marrow Transplantation Registry，IBMTR)推荐的检测移植嵌合状态的"金标准"[5]。笔者所在医疗中心目前采用STR-PCR技术进行嵌合率监测，该技术通过对15个位于常染色体的STR位点及1个位于性染色体的AMEL位点的监测，识别供者和受者的细胞身份，通过遗传分析仪检测供、受者细胞数，计算峰高和面积得到供、受者细胞嵌合率，该检测方法在实际应用中证实具备上述各项优点，高效、准确率高。
全血细胞嵌合状态是指分离受者骨髓或外周血的有核细胞，进行移植物来源分析，得到嵌合体中供者DNA所占百分比，并以此进行临床干预治疗。不同免疫细胞亚群嵌合状态较全血细胞嵌合状态则更为有针对性[6]。分选嵌合是指以单个核细胞为起点，用免疫磁珠分选不同免疫细胞亚群，并结合STR-PCR技术建立的免疫细胞嵌合性定量分析方法。由于不同免疫细胞亚群的功能、植入动力学及生存时间等生物学特性不同，因此在评估移植后相关临床事件的敏感度和特异度亦有差异，如不同免疫细胞亚群在受者体内植入方面，淋巴细胞完全嵌合状态出现时间早于髓细胞系细胞(CD14＋/CD15＋细胞)[7]。研究亦表明，在淋巴细胞系中最早出现FDC的是自然杀伤(natural killer，NK)细胞，其次是T细胞，最后是B细胞[8]。
Allo-HSCT的预处理方案可分为清髓性预处理(myeloablative conditioning，MAC)方案和减低剂量预处理(reduced-intensity conditioning，RIC)方案。根据预处理方式不同，allo-HSCT亦被分为常规剂量清髓性异基因造血干细胞移植(conventional-intensity allogeneic stem cell transplantation，CST)和非清髓性异基因造血干细胞移植(non-myeloablative allogeneic stem cell transplantation，NST)。经典MAC方案主要采用大剂量全身照射(total body irradiation，TBI)和化疗，以克服宿主抗移植物(host versus grate，HVG)和移植物抗宿主(grate versus host，GVH)2种免疫反应，使供者细胞完全植入，替代异常的宿主细胞并产生移植物抗白血病效应(graft versus leukemia，GVL)。CST后供者细胞植入稳定可靠，GVL作用强，原发病复发率低，治疗效果好，可使患者获得长期生存。但MAC方案具有相关毒性反应显著、并发症较多等缺点，可使患者由于受到年龄及身体状况等限制而失去移植机会，影响患者的长期生存和生活质量。RIC方案则可减少预处理相关并发症，从而使allo-HSCT的适用范围更广泛。采用不同预处理方案的allo-HSCT患者，其免疫细胞亚群嵌合率检测均可以在移植早期判断抑制物植入状态，预测GVHD及移植后复发的可能性，同时在指导免疫抑制剂调整和供者淋巴细胞输注的具体方案上发挥重要作用。临床医师可根据嵌合率监测结果，进行早期临床干预治疗，提高供者细胞植入率，尽早预防排斥及复发，减少GVHD发生，这对延长allo-HSCT后无病生存(disease free survival，DFS)期及提高DFS率具有重要意义[9,10,11]。此外，嵌合率监测主要针对T、B、NK细胞等不同免疫细胞亚群进行监测。目前，T细胞嵌合率动态监测已广泛应用于allo-HSCT后早期嵌合状态的监测，并且对于评估aGVHD具有重要意义。但是，对于何时进行嵌合率监测及嵌合率处于何种范围时对预测GVHD具有临床意义，学术界暂未达成一致结论，仍需进一步研究结果证实。
NST主要针对年龄>50岁的老年患者或器官功能不全者，由于其预处理剂量减轻，治疗效果肯定，对患者机体损伤小，GVHD发生率相对降低。因此，该方法已越来越受到关注，尤其对于幼龄患儿、年龄>50岁的老年患者，以及体质差难以接受MAC方案者，是一种非常有益的选择。但接受NST受者的复发风险会增高。因此，对NST后受者不同免疫细胞亚群的嵌合率监测具有重要的临床意义。
allo-HSCT后，定期监测外周血不同免疫细胞亚群嵌合状态可以早期判断植入状态。B细胞嵌合率的监测对GVHD的影响目前尚无明确定论，但在早期植入的不同免疫细胞亚群数量方面，Panse等[12]对125例进行NST患者B细胞嵌合率的研究结果显示，若植入B细胞的数量多则患者预后好，但是植入B细胞数量多可导致慢性GVHD的发生风险相对增高。该研究还指出，早期植入的B细胞数量越多，对达到FDC、防止原发病复发亦具有重要临床意义。蒋英[13]通过对65例行allo-HSCT(包括31例NST患者和34例CST患者)早期移植后DC监测的结果显示，虽然NK细胞可在移植早期达到FDC，而T细胞达到FDC较NK细胞晚，但是移植后7、14 d T淋巴细胞嵌合率较高的患者发生aGHVD几率亦较高。因此，以T细胞早期嵌合状态判断移植物早期植入状态更为合理。
在预测GVHD方面，Baron等[14]对282例血液系统恶性疾病患者NST后早期(＋14、＋28、＋42 d)T细胞嵌合状态进行了研究，结果显示，早期高T细胞嵌合率和aGVHD的发生风险显著相关(P＝0.01)。同时，该研究还指出早期高NK细胞嵌合率与aGVHD的发生风险并无明显相关关系(P＝0.38)。Miura等[15]研究结果与Baron等[14]相符，其进一步分析36例CST和34例NST患者移植后的CD3＋、CD14、CD15＋和CD56＋细胞的嵌合状态，结果显示，Ⅱ～Ⅳ级aGVHD的NST患者移植后14 d时的CD3＋细胞嵌合率>50%，与比较，差异有统计学意义(P＝0.029)。该结果亦进一步证实，移植早期T细胞嵌合率较高时，易发生aGVHD。El-Cheikh等[16]发现伴Ⅱ级及以上aGVHD患者在移植后120 d的T细胞均达到FDC，而未发生aGVHD者的T细胞表现为MC。Petersen等[17]通过对24例行NST后患者的T细胞嵌合状态的研究，得出结论，aGVHD发生时T细胞MC较常见。慢性移植物抗宿主病(chronic graft versus host disease，cGVHD)由于发病原因不明，预防措施有限，不同细胞亚群分选嵌合状态监测对预测cGVHD发生尤为重要。Perruche等[18]研究表明，NST受者的cGVHD发生与供者来源B细胞的嵌合率低可能相关。但是，由于导致该类患者发生cGVHD因素具有多样性，因此上述结论中，B细胞嵌合率与cGVHD的相关性需进一步研究证实。
在预估复发方面，现阶段研究表明，若allo-HSCT患者移植后嵌合率高则复发率低、DFS率较高。对于髓系血液系统恶性疾病，如急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)，慢性髓细胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)，骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome，MDS)患者。Mohty等[20]监测41例患者接受NST后的CD3＋ T细胞的动态嵌合状态，结果显示，患者T细胞完全嵌合延缓者较未延缓者易复发(0/26比6/15，P＝0.002)。同时，该研究者认为NST后应该常规监测T细胞的嵌合状态。Koreth等[21]研究发现，行NST后，DC<90%提示患者的复发风险增加(HR＝2.54，P<0.000 1)，而且移植第100天的DC结果比第30天的预测价值更大。Baron等[14]通过对接受NST后早期(＋14、＋28和＋42 d)NK细胞嵌合率监测结果显示，NK细胞嵌合率高，则复发风险低。在预估GR方面，Matthes-Martin等[22]通过对39例接受NST的儿童患者移植后14～100 d经流式细胞仪分选后(CD14＋，CD15＋，CD3－/CD56＋，CD3＋/CD4＋，CD3＋/CD8＋，CD19＋)的细胞嵌合状态进行研究，结果显示，移植后第28天T细胞嵌合率为62%，NK细胞嵌合率为39%，其他单核细胞和粒细胞嵌合率为38%，并且二次移植中GR发生与低NK细胞嵌合率有显著相关性(P<0.000 1)，其次是和T细胞嵌合水平相关(P<0.001)。该研究结果提示，存在T细胞嵌合的情况下，NK细胞嵌合状态可以预测移植后期GR的发生。
在脐血移植方面，Kwon等[23]研究脐血移植后早期T细胞嵌合状态，结果显示，若脐血T细胞嵌合率高，则移植物植入成功率越高。因此，可通过移植后早期T细胞嵌合状态预测脐血移植后植入状态，以便尽早制定相应治疗策略。
在CST后供者细胞植入稳定可靠，GVL作用强，白血病复发率低。但有文献指出，在MAC方案处理后4周甚至更长时间，受者T细胞仍可被检测到[24]。因此，对CST后受者不同免疫细胞亚群嵌合率的监测，对预测GVHD、复发、GR等方面同样具有较大意义。
CST早期T细胞若处于较高嵌合状态，则易发生aGVHD。Minculescu等[25]对62例行CST患者T细胞嵌合率进行研究，其中包括38例达FDC患者和24例达MC患者，结果显示，FDC患者aGVHD发生率明显高于MC患者(6/38比0/24)，并且差异有统计学意义(P＝0.04)。Guz等[26]研究结果与之相同，AML患者行CST后，若其移植后14 d时T细胞嵌合率>95%，则易发生aGVHD。Jiang等[27]分析124例allo-HSCT患者(包括87例CST患者和37例NST患者)的外周血中T细胞嵌合率，结果显示，aGVHD的发生与T细胞达FDC的时间有相关性(P＝0.035)，并且若患者在移植后第7天时的供者来源T细胞嵌合率>69%，则发生aGVHD的风险高。
在预估GR等方面，Dubovsky等[28]研究结果显示，移植后14 d是否达到MC对预测早期GR十分重要，CST后血细胞达到MC的平均时间为移植后8 d者，最终均获移植成功，而在移植后14 d仍未达到MC者，将可能发生GR，导致植入失败。该研究还指出，移植后若患者出现长时间MC或免疫细胞嵌合率下降，同时无GVHD表现且未出现复发时，通过免疫抑制剂减量可促使供者细胞植入，使供者各免疫细胞亚群均达到FDC，避免临床复发。Breuer等[29]对192例儿童恶性、非恶性血液系统疾病患者进行移植后(经RIC或MAC方案处理)各免疫细胞亚群嵌合率的监测，结果显示，供者来源T细胞嵌合率>50%时，发生GR风险较低(1.4%)。这表明，移植后早期(＋14和＋28 d)监测T细胞和NK细胞嵌合率可以预估GR风险。
在预测原发疾病复发上，Terwey等[30]分析101例接受CST后患者的嵌合状态，结果显示，FDC、稳定的MC及受者细胞数目下降的MC患者有相似的复发风险，但受者细胞持续性增多的MC患者复发风险将会增高。Broqlie等[31]通过对63例儿童患者(包括45例接受CST患者和18例接受NST)行allo-HSCT后T细胞嵌合率监测，结果显示，67%(12/18)复发患儿早期T细胞嵌合率<97%；在未复发患儿中，出现Ⅱ级及以上aGVHD患者为10例(24%)，而在复发患者中仅为4例(18%)。上述结果提示，allo-HSCT后早期T细胞嵌合率高，复发风险相对较低，但发生aGVHD风险增加。与之有相同结论，Chen等[32]对55例行allo-HSCT患者移植后30 d嵌合率的监测结果显示，移植后30 d内达到FDC的31例患者中，后期复发者为6例(19%)，而未在移植后30 d内达到FDC的24例患者中，后期复发者为12例(50%)，这提示，allo-HSCT后若可早期获得FDC，则后期复发率低。但是，Mellgren等[33]则认为早期CA预测白血病复发的有效性是有限的。因此，CST后监测嵌合率对复发的预测价值，仍需进一步研究证实。
近年来，影响allo-HSCT患者预后的主要因素是疾病复发，而过继性免疫细胞疗法(adoptive cellular immunotherapy，ACI)则是复发的主要干预治疗措施之一。ACI主要包括供体淋巴细胞回输(donor lymphocyte infusion，DLI)，停用免疫抑制剂和应用细胞因子等方式。大量临床实践证实，DLI是治疗allo-HSCT后白血病复发最有效的手段之一。曾有研究证实，行DLI治疗有效的allo-HSCT患者，其嵌合率均出现回升[34]。受者细胞嵌合比例进行性增高或出现FDC向MC发展时，均为输注DLI的治疗时机[35]。Liga等[36]研究结果显示，DC进行性下降时，应用DLI可提高受者生存率。但是，Horn等[37]提出，为防止延误治疗时机，应将患者出现MC时即作为DLI的治疗时机。Antin等[35]指出，患者行NST后，若出现DC下降、稳定MC超过2周，以及病情持续不缓解，或者有进展趋势，均可考虑采用DLI治疗。DLI后，若治疗有效，受者细胞嵌合比例的动态监测结果可提示DC回升。而动态监测嵌合率也可以防止因过度DLI治疗而导致严重的骨髓抑制、GVHD等并发症。因此，动态监测供、受者细胞嵌合率，在指导应用DLI治疗的同时，也可及时调整输注剂量和疗程，避免过度治疗。
Allo-HSCT后通过对患者嵌合率的监测，可以用于对免疫抑制剂的调整。免疫抑制剂通过抑制淋巴细胞功能、减少炎性细胞因子的产生和预防aGVHD等作用，提高allo-HSCT患者的长期生存，以及保持移植物良好功能。但长期应用免疫抑制剂在有效控制aGVHD的同时，也会抑制GVL效应，增加疾病复发风险，并可能影响FDC的形成。因此，通过密切监测嵌合率，可以指导临床合理调整免疫抑制剂剂量，使其在不削弱GVL作用的同时更好预防GVHD的发生[38]。Dubousky等[28]研究结果显示，若患者FDC转为MC或DC进行性下降，可考虑免疫抑制剂剂量减量或停用，以再次获得FDC，若能回到FDC状态，应考虑恢复免疫抑制剂剂量，防止GVHD的发生，若无法逆转至FDC状态，则应考虑采用DLI治疗。但由于DLI对于复发急性白血病的疗效有限，并且可能发生严重GVHD等并发症，故二次移植则是挽救移植后复发的另一方案。Umeda等[39]研究表明，DC≥30%者可行DLI治疗，而DC<30%者则适合行二次移植。因此，通过监测供者细胞嵌合状态，可帮助临床选择合适的治疗方案。
Allo-HSCT后患者的嵌合状态呈动态变化过程，随着基础疾病的治疗及造血系统功能的恢复，最初的FDC状态可能继续保持稳定的FDC，也可能随受者细胞比例增多转变为MC，亦可能随着供者细胞逐渐减少而导致GR。同样，如果在移植早期检测到的MC可能维持稳定的MC，或者因供者细胞增多而达到FDC状态，也可能由于受者细胞增多，而导致植入失败或是原发病复发。因此，探究影响allo-HSCT后患者嵌合状态的因素，可提前进行相应临床干预，从而提高受者移植后的生存质量。
移植前相关因素主要包括患者的基本状况如年龄、性别等，移植前疾病类型如淋巴细胞性白血病，髓细胞系白血病，再生障碍性贫血(aplastic anemia，AA)等。其中，患者的年龄与性别是否影响移植后嵌合状态目前尚无统一结论，而在疾病类型方面，有研究通过对不同类型血液病(髓系白血病、淋巴细胞白血病)患者移植后30 d体细胞和T细胞嵌合率进行监测比较结果显示，二者差异并无统计学意义(P>0.05)[19]。而Mickelson等[24]研究结果显示，MDS患者与淋巴瘤患者相比，后者更易形成DC较高的供者细胞嵌合状态。这与Baron等[40]研究结果相似。Mccann等[41]通过对71例AA患者allo-HSCT后嵌合率的研究发现，维持稳定的MC即可取得与FDC相近的生存率，但如果受者细胞比例出现增高趋势，MC可能导致GR。
移植相关因素主要包括预处理方案、造血干细胞来源及数量等对嵌合率的影响较大的因素。Berglund等[42]研究结果显示，allo-HSCT前增加预处理强度可以削弱HVG反应，从而有利于供者细胞的植入。而高剂量的造血干细胞及淋巴细胞的输注，有利于供者细胞的植入与DC的提高[40]。Ketterl等[43]研究135例非血液系统恶性疾病(如范可尼贫血症、免疫缺陷病等)在allo-HSCT后的CD3＋、CD15＋细胞嵌合状态，发现CD3＋、CD15＋细胞嵌合状态与不同预处理条件相关，MAC方案处理下CD3＋细胞嵌合率低的患者数量较RIC方案处理下CD3＋细胞嵌合率低者更多。在供者来源方面，Stikvoort等[44]研究结果显示，接受亲缘供者allo-HSCT患者比接受无关供者的患者更容易出现MC，但Baron等[40]研究结果显示，造血干细胞移植后受者T细胞的嵌合状态，与接受亲缘供者或无关供者无明显相关性。同时，该研究还指出，行allo-HSCT后患者的供者来源T细胞嵌合率高于接受骨髓移植(bone marrow transplantation，BMT)的患者，并且差异有统计学意义(P＝0.002)，这或许是由于allo-HSCT输入的造血干细胞数量及淋巴数量更多，更有利于提高DC。而MAC方案虽然增加预处理方案的强度可以削弱HVG反应，从而提高供者细胞的植入率，但对于年龄较大或是一般状况较差而不能耐受MAC方案的患者，更倾向于采用RIC方案。近年来，笔者所在医疗中心一直研究采用RIC方案，高剂量输注造血干细胞等措施提高移植物植入率，以提高allo-HSCT根治血液系统疾病的患者年龄上限，从而提升allo-HSCT后高龄患者的生活质量及DFS率。Hong等[45]对行RIC方案allo-HSCT后受者嵌合状态进行研究，共纳入897例患者，其中382例患者接受氟达拉滨＋TBI处理，而515例患者仅接受氟达拉滨处理，研究结果显示，接受氟达拉滨＋TBI患者获得FDC的患者比例为82%(314/382)，显著高于仅接受氟达拉滨处理者的64%(330/515)，并且差异有统计学意义(P＝0.006)。
除此之外，不同嵌合率监测方法及监测敏感度也是影响嵌合率的因素。Cechova等[46]对1998－2013年行allo-HSCT后474例患者嵌合率进行监测，其中，对第1组337例患者采用VNTR＋STR监测方法，对第2组137例患者采用RQ-PCR技术监测，结果显示，第1组患者中仅可发现FDC与MC，其灵敏度较低并且无法区分Mc状态，而第2组采用RQ-PCR技术监测，不仅可区分FDC与MC，并且更能清晰发现Mc。这提示，采用不同嵌合率的监测方法，监测结果会存在差异。Ahci等[47]与之得出相同结论。因此，选择合适、准确、高灵敏度的嵌合率监测方法，对于实时监测allo-HSCT患者的嵌合率，根据其嵌合状态及时掌握疾病转归和预后显得尤为重要。
近年来，随着HLA配型技术的提高、供者选择的多样化，以及相关支持治疗的不断改善，allo-HSCT在治疗血液系统疾病及恶性实体肿瘤中被广泛应用，而如何增加移植物植入率，减少复发风险，有效预测和治疗GVHD，提高allo-HSCT患者的生活质量等方面显得越来越重要。大量研究结果表明，嵌合状态与稳定的供者细胞植入、原发病复发、GVHD发生等密切关系。因此，选择合适的嵌合率监测方法，早期动态监测allo-HSCT患者的嵌合率，可以更好指导临床干预治疗，为尽早做出移植干预补救措施(如供者细胞再输注、二次移植等)提供有力证据，从而进一步提高患者移植后生存率和生活质量。
所有作者均声明不存在利益冲突
