多发性骨髓瘤(MM)为一类浆细胞恶性克隆增殖性疾病，该病以大量浆细胞聚集于骨髓，导致骨质破坏、造血功能衰竭、产生M蛋白等为特征。近年来随着新药的应用，MM患者的缓解率及生存期获得显著提高，但是大多数患者仍会出现疾病复发、进展或者耐药。因此，寻求新的MM治疗策略迫在眉睫。嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)免疫疗法为近年肿瘤免疫治疗领域中备受关注的细胞治疗技术。CAR-T可以通过特异性识别靶抗原杀伤MM细胞，为MM患者带来新的治疗选择。笔者拟就CAR-T治疗MM的相关靶点、CAT-T存在的问题及提高其有效性的措施等方面进行阐述。
版权归中华医学会所有。
未经授权，不得转载、摘编本刊文章，不得使用本刊的版式设计。
除非特别声明，本刊刊出的所有文章不代表中华医学会和本刊编委会的观点。
多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)系浆细胞恶性克隆性疾病，目前其发病率居血液系统恶性肿瘤第2位，约占10%。近年，我国MM发病率有逐年增高及患者年轻化的趋势。尽管随着硼替佐米、来那度胺等新药及造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)的应用，MM的疗效有所提高，但是迄今为止，MM仍是不可治愈的疾病，其预后并未获得根本改善。目前，嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell，CAR-T)免疫疗法在血液系统恶性肿瘤患者中，取得了较好的临床效果，特别是在治疗MM方面进展显著。因此，笔者拟就CAR-T免疫疗法在MM中的研究进展进行阐述。
嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)由细胞外抗原结合区、铰链区、跨膜区与细胞内信号转导区构成，其中细胞外抗原结合区来源于单克隆抗体的单链可变区片段(single-chain variable fragment，scFv)。scFv具有特异性识别并结合肿瘤相关抗原的功能，而且不受主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex，MHC)分子的限制，直接识别肿瘤细胞表面的靶抗原。
CAR-T免疫疗法的作用机制如下。利用基因工程技术将CAR基因转染至T细胞内，使这种经基因修饰的T细胞表达特异性的CAR，然后经体外扩增、纯化，所得CAR-T即可以通过非MHC限制的方式识别肿瘤细胞表面的特定抗原，特异性靶向杀伤肿瘤细胞，从而将特异性识别肿瘤相关抗原的功能与T细胞的细胞毒活性相结合，达到治疗肿瘤的目的[1]。目前，第4代CAR-T免疫疗法，即TRUCK中引入了炎症因子白细胞介素(interleukin，IL)-12与共刺激配体(4-1BBL与CD40L)，提升了T细胞的扩增活性与存活时间，从而能够诱导更为广泛的抗肿瘤效应[2,3]。
目前，不同靶点CAR-T治疗MM的相关体内、外研究陆续报道。尚未发现仅特异性表达于浆细胞表面，而不表达于正常细胞表面的抗原。目前，B细胞成熟抗原(B cell maturation antigen，BCMA)CAR-T治疗MM的临床研究较多，笔者分为BCMA CAR-T及其他非BCMA CAR-T二部分进行阐述。
BCMA，即CD269为目前MM CAR-T治疗中研究最多的靶点之一。BCMA主要表达于浆细胞表面，不表达于初始B细胞(naïve B cell)或者造血干细胞，属于肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)受体超家族成员，其通过B细胞活化因子(B cell activating factor of the tumor necrosis factor，BAFF)与增殖诱导配体(a proligeration inducing ligand，APRIL)调节B细胞的成熟与分化。有研究结果表明，BCMA为特异性表达于MM细胞表面的受体蛋白，并且随着疾病进展，表达水平逐渐增高[4]。Ali等[5]首次应用BCMA CAR-T治疗难治性MM患者，研究结果显示BCMA CAR-T能够清除患者肿瘤负荷，使其获得完全缓解(complete remission，CR)。慢病毒载体编码的BCMA CAR由4个独立的抗BCMA单链可变片段，与CD137(4-1BB)共刺激分子及CD3ζ信号转导区融合而构成，其中相关研究最为广泛的是经慢病毒转染制备的BCMA CAR-T(BB2121)。经BB2121转染获得的BCMA CAR-T(BB2121)能够迅速且持续杀伤人MM、Burkitt淋巴瘤等疾病模型及NSG小鼠体内的肿瘤细胞；并且经BCMA CAR-T治疗后的小鼠全部存活[6]。该研究结果进一步证实，BCMA CAR-T可以作为MM及部分淋巴瘤的潜在治疗手段[6]。
由于靶抗原呈阳性或者阴性MM细胞再次出现，部分MM患者接受BCMA CAR-T治疗后疾病复发。因此，需要针对靶抗原的丢失及提高CAR-T的持久性方面对CAR-T进行改造。Chen等[7]将完整的BCMA-CAR通过P2A自剪切肽类连接完整的CS1 CAR形成一种复合嵌合抗原受体(compound chimeric antigen receptor，cCAR)，从而在T细胞表面表达2种功能性CAR分子。将这种BCMA-CS1 cCAR-T应用于MM小鼠模型，显示出强大的抗肿瘤活性，应用BCMA-CS1 cCAR-T小鼠存活期较应用BCMA CAR-T小鼠更长(P＝0.033 9)。上述研究结果表明，将BCMA与CS1作为复合靶点的CAR-T，可以增强对MM的治疗反应，并且有望为更广泛的疾病提供有效的临床治疗。
CD19为B细胞在各个增殖、分化阶段均表达的细胞膜表面蛋白之一。目前，针对CD19 CAR-T的临床研究较多，主要集中于淋巴瘤与白血病。虽然超过95%的MM患者缺乏CD19表达，但是有文献报道，低分化的CD19＋细胞可能与MM疾病进展与耐药相关[8]。体外研究结果表明，CD19 CAR-T对低表达CD19的浆细胞具有细胞毒性[9]，Garfall等[9]报道了1例MM患者经大剂量美法仑与自体造血干细胞移植(autologous hematopoietic stem cell transplantation，auto-HSCT)后，联合CD19 CAR-T治疗获得较长时间的CR。
CS1在B细胞，T细胞，树突状细胞，自然杀伤(natural killer，NK)细胞与单核细胞表面均有表达，超过95%的MM患者高表达CS1，使其成为免疫治疗的靶点[10,11]。有研究结果表明，MM患者血清可溶性CS1水平与疾病分期相关，国际分期系统(International Staging System，ISS)分期Ⅱ/Ⅲ期患者血清CS1表达水平明显高于Ⅰ期者(9.0 ng/mL比5.9 ng/mL，P＝0.006)[12]，并且CS1可以在体外诱导MM细胞生长[13]。在高表达CS1的MM细胞系与MM.1S免疫缺陷小鼠模型中，CS1 CAR-T对高表达CS1的MM细胞系具有较强的杀伤作用[14]。Wang等[15]发现，在体外扩增的CS1 CAR-T中加入雷利度胺，可以提高CS1 CAR-T的免疫功能，包括细胞毒性、免疫记忆的维持，以及辅助性T细胞(helper T cell，Th)1相关细胞因子的分泌与免疫突触的形成。CS1 CAR-T联合雷利度胺的体外实验结果为复发/难治性MM的临床试验提供了依据。不同于T细胞，NK细胞为更安全的免疫效应细胞，将其应用于免疫疗法可以避免细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome，CRS)，肿瘤溶解综合征及脱靶效应等潜在并发症的发生。采用CAR对NK细胞进行修饰获得的CS1-CAR-NK细胞在体外对过表达CS1的人骨髓瘤细胞株U266具有较强的细胞毒作用，并且能够促进γ干扰素分泌。在NSG小鼠尾静脉注射5×109个人骨髓瘤细胞株IM9后第7天输注表达CS1-CAR的NK-92细胞(NK-92-CS1-CAR细胞)，结果显示，NK-92-CS1-CAR细胞能够有效地抑制人IM9骨髓瘤细胞的生长，与单纯输注NK-92细胞相比，可以显著延长小鼠的生存期(60 d比40 d，P<0.05)[16]。
CD70亦称为CD27配体，体外实验发现，将CD70 CAR-T与CD70＋ MM细胞系U266共培养，CD70 CAR-T能够显著分泌γ干扰素与IL-2，进而对CD70＋ U266细胞发挥肿瘤杀伤作用，同时在异基因移植淋巴瘤小鼠模型中发挥抗肿瘤活性[17]。可能由于CD70并非特异性表达于恶性浆细胞表面，目前尚缺乏与MM相关的临床研究。
CD44v6为CD44的异构体6，造血干细胞不表达CD44v6，正常细胞，包括活化的T细胞、单核细胞与角质细胞表面低表达[18]。MM患者来源的CD138＋浆细胞表达CD44v6，并且其表达水平与疾病进展程度及染色体13q14缺失相关(P＝0.01)[19]。研究表明，CD44v6.CAR28z＋ T细胞在不影响造血干细胞与表达CD44v6的浆细胞功能的同时，介导较强的抗MM作用；而体外对CD44v6.CAR28z＋ T细胞进行CD3/CD28与IL-7/IL-15的活化，是该细胞发挥抗肿瘤活性所必需的[18]。
CD56被认为是恶性浆细胞潜在靶抗原。在MM异基因移植小鼠模型的研究发现，CD56 CAR-T治疗能够有效清除MM模型小鼠的肿瘤细胞[20]。由于CD56在神经元细胞表面亦存在表达，可能产生神经细胞毒性，因此限制了CD56 CAR-T在临床中的应用[20]。
Hosen等[21]研究鉴定出，MMG49为MM的特异性单克隆抗体，能够特异性识别并活化整合素β7。分别在骨髓瘤细胞株MM.1S及RPMI8226接种的异基因移植NSG小鼠模型中输注MMG49 CAR-T，可显著降低小鼠体内肿瘤负荷，延长小鼠生存期。该研究结果亦显示，MMG49 CAR-T并不能杀伤敲除了整合素β7的MM.1S细胞。MMG49 CAR-T能够在不损伤正常组织的情况下，发挥特异性抗MM效应[21]。该研究亦证实，MMG49 CAR-T不仅可以靶向杀伤MM细胞，亦可以靶向杀伤潜在的MM前体细胞克隆性CD19＋ B细胞[21]。
CD138在MM细胞表面高表达，与MM细胞生长及疾病进展密切相关[22]。体外实验结果显示，CD138 CAR-T对骨髓瘤细胞U266、RPMI8226具有明显杀伤效果。CD138 CAR-T与肿瘤细胞共培养可以促进γ干扰素的分泌。泊马度胺能够促进CD138 CAR-T分泌γ干扰素[23]。Guo等[24]纳入5例难治性MM患者采用CD138 CAR-T进行治疗的结果显示，4例患者疾病稳定超过3个月，1例患者外周血浆细胞比例由10.5%降低至3.0%以下。但是由于上皮细胞亦表达CD138，CD138 CAR-T可攻击上皮细胞，因此其在MM中的临床应用尚需进一步研究证实。
CD38在骨髓瘤细胞表面高表达提示，CD38可以作为MM的CAR-T治疗潜在靶抗原。虽然，Mihara等[25]在体外实验中发现CD38 CAR-T对骨髓瘤细胞有较强的细胞毒性作用，并且存在时间与剂量依赖性，但是由于CD38表达较为广泛，所以治疗中产生的不良反应需引起重视。Drent等[26]通过建立CD38 CAR-T小鼠病理模型，引入自杀基因caspase-9，可以调控CD38 CAR-T的死亡。该实验结果证实，CD38 CAR-T能够分泌相关细胞因子，并且诱导CD38＋ MM细胞裂解[26]。
有研究发现，免疫球蛋白κ轻链的单克隆抗体MDX-1097可以通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)杀伤MM细胞，来那度胺可以上调MM细胞表面免疫球蛋白κ轻链的表达水平，进而增强MDX-1097对MM细胞的杀伤作用，诱导MM患者疾病缓解[27]。Ramos等[28]针对细胞表面表达免疫球蛋白κ轻链的骨髓瘤细胞制备κ-CAR-T，对7例MM患者进行治疗，其中6例既往接受auto-HSCT，3例在接受κ-CAR-T输注前4周接受了化疗，研究结果显示，4例患者6～24个月无疾病进展，3例患者对κ-CAR-T治疗无反应[28]。
Peinert等[29]研究发现，在MM细胞株RPMI8226-13高表达Lewis Y，同时52% MM患者的骨髓单个核细胞表达Lewis Y。以Lewis Y为靶点的融合基因anti-LeY-scFv-CD28-ζ转染T细胞获得LeY CAR-T。LeY CAR-T对RPMI8226-13细胞与原代MM细胞具有特异性杀伤作用，并且可以在体内长期发挥抗MM作用[29]。
自然杀伤细胞受体2D(natural killer cell receptor group 2, member D，NKG2D)为NK细胞与T细胞的活化受体，其配体表达于多种肿瘤细胞，包括MM细胞。在骨髓瘤5T33MM-GFP小鼠模型中，与接受野生型T细胞处理的小鼠比较，接受NKG2D CAR-T(chNKG2D T细胞)处理的小鼠存活率增高(P<0.001)。单一剂量的NKG2D CAR-T即能够延长小鼠生存期，并且半数(5/11)小鼠能够长期存活，而接受野生型T细胞处理的小鼠30 d内全部死亡。二次输注NKG2D CAR-T后，小鼠全部获得无肿瘤生存，而接受野生型T细胞处理的小鼠40 d内全部死亡。NKG2D CAR-T不仅可以延长小鼠无肿瘤生存期，亦可以激活宿主免疫应答，如增加肿瘤部位活化的宿主NK细胞、T细胞及小鼠血清γ干扰素水平。存活的小鼠对5T33MM细胞再次输注产生免疫反应，表明NKG2D CAR-T诱导小鼠体内产生保护性、特异性的免疫反应[30]。有研究结果显示，NKG2D CAR-T能够下调调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)数量，诱导并促进免疫反应激活。同时，蛋白酶体抑制剂硼替佐米、美法仑等可以增强MM细胞表面NKG2D配体的表达，因此联合这些药物可以增强NKG2D CAR-T对MM细胞的识别，进而增强杀伤作用[31]。
随着CAR-T免疫疗法的迅速发展，在临床前及临床试验中已经取得初步成效，但是也存在一些问题。①脱靶效应。脱靶效应是指CAR-T与肿瘤相关抗原具有高度亲和性，容易由于识别错误而杀伤正常细胞的现象。因此，应选择特异性表达于肿瘤表面的靶抗原，提高杀伤的特异性，进而避免此类不良反应的发生[32]。② CRS。在T细胞活化后，在短时间内清除肿瘤细胞的同时会产生大量炎症因子，引起机体炎症反应，从而释放大量细胞因子，临床上主要表现为发热、心动过速、低血压、呼吸系统症状等。若患者发生CRS，可以采用激素冲击与IL-6受体抑制剂降低CRS相关死亡风险[33,34]。③插入突变。将外源性基因通过基因工程技术整合至正常T细胞中，存在插入突变而致癌的风险。利用最新的成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)/CRISPR相关核酸酶(CRISPR-associated nuclease，Cas)9技术将CAR的这段基因定点插入到原来的T细胞的TCR基因位置，可以避免采用逆转录病毒或者慢病毒随机插入带来的基因突变而致癌的风险[35]。④ CAR-T在体内的存活时间。通过预化疗或者放疗清除体内抑制性Treg，可以促进CAR-T在体内的存活[36]。通过直接补充或者基因编辑技术使CAR-T分泌相关细胞因子，提高CAR-T的持续存活[37]。或者通过CAR-T多次回输、制备特殊表型的T细胞等方法促进体内CAR-T的存活。有研究者发现在接受BCMA CAR-T治疗的MM患者中，几乎全部患者均出现了疾病进展，这表明CAR-T具有较强的清除肿瘤细胞的能力，但是可能无法提供长期的免疫监测与治疗作用[38]。究其原因在于治疗后残留的MM细胞表面BCMA表达水平减少或者缺失。目前，MM细胞表面BCMA表达的潜在调控机制尚不明确，但是有研究发现治疗后初期BCMA表达水平将减低或者缺失，但是随着疾病进展可以重新正常表达。γ分泌酶抑制剂能够通过阻断细胞表面BCMA被降解，从而提高BCMA CAR-T治疗MM的有效性[39]。应用BCMA CAR-T联合γ分泌酶抑制剂治疗MM的临床试验(NCT03502577)正在进行中。
异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)后，应用患者来源的CAR-T时，较大的肿瘤负荷可以导致机体免疫功能受损，导致患者来源的CAR-T可能难以有效扩增，因此对于移植后复发/难治性B细胞肿瘤可以回输供者来源CAR-T。多项研究结果显示，在B细胞恶性肿瘤患者接受allo-HSCT后，供者CD19 CAR-T具有持久的移植物抗白血病(graft versus leukemia，GVL)效应，而不引起移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)效应[40,41]。Garfall等[42]纳入接受大剂量马法兰联合auto-HSCT治疗后复发的10例复发/难治性MM患者，应用CD19 CAR-T联合auto-HSCT进行治疗，结果显示与第1次auto-HSCT疗效相比，有2例患者反应持续时间较长。这提示，CD19 CAR-T联合auto-HSCT为复发/难治性MM患者的潜在治疗方案。
CAR-T与免疫检查点抑制剂的联合应用可以减弱免疫抑制信号对CAR-T活性的抑制。有动物实验结果表明，人类表皮生长因子受体(human epidermal growth factor receptor，HER)2 CAR-T与程序性细胞死亡因子(programmed cell death，PD)-1单克隆抗体联合应用，对肿瘤的杀伤作用强于单独应用CAR-T[43]。这是由于PD-1单克隆抗体可以封闭T细胞的程序性细胞死亡因子配体(programmed cell death ligand，PDL)-1，抑制PD-1与肿瘤的PD-1结合，从而增强了CAR-T的杀伤作用[43]。同时，该研究发现，将治疗慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)的CD19 CAR-T与免疫调节药依鲁替尼联合应用能够下调肿瘤细胞表面PD-1的表达水平，从而提高CD19 CAR-T杀伤肿瘤细胞的作用。在MM患者恶性浆细胞表面PDL-1表达水平增加，而T细胞与NK细胞PD-1表达水平亦升高[44]。Badros等[45]采用pembrolizumab(PD-1单克隆抗体)联合来那度胺与地塞米松治疗48例复发/难治性MM患者的临床研究结果显示，治疗后患者客观缓解率为50%；在后续研究中将来那度胺替换为泊马度胺，客观缓解率增加至60%[45]。基于PD-1/PDL-1抑制剂及针对MM细胞表面抗原的抗体具有协同作用的临床前期研究，可以将CAR-T与免疫检查点抑制剂联合应用以提高CAR-T的有效性。此外，MM患者异常的免疫微环境，抑制Th1与CAR-T的正常功能。而armored CAR-T可以通过产生内源性细胞因子(IL-12、-15、-21)及增强共刺激信号来改善MM细胞微环境，提高CAR-T的有效性，是理想的下一代抗原特异性工程T细胞[46]。
近年，CAR-T技术取得了突飞猛进的发展，使T细胞突破了MHC的限制性，识别与杀伤肿瘤细胞的能力显著增强。如何寻找特异性更高、刺激作用更强的靶点，提高对肿瘤细胞的杀伤效率，降低CAR-T对正常组织的损伤，提高治疗安全性为当前CAR-T免疫疗法所面临的挑战。理想的MM靶点应该具备以下特征。①必须在骨髓瘤细胞表面表达；②在正常组织中尽可以能低表达；③在特定患者群体的肿瘤细胞中均存在表达；④具备MM生理学和(或)病理生理学方面的主要功能，以防止在有效的免疫治疗选择下出现表达水平下调。CAR-T发挥免疫杀伤作用，依赖于与肿瘤细胞相互接触，需要克服肿瘤局部免疫抑制微环境的影响[47,48]。如何使CAR-T迁移至肿瘤部位，克服肿瘤免疫抑制微环境，发挥杀伤作用是CAR-T临床应用的另一挑战。未来MM中CAR-T治疗联合新药或者HSCT的疗效需要更多的研究予以评估。
所有作者均声明不存在利益冲突
