阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、镰状细胞性贫血等溶血性疾病患者发生血管内溶血时，体内可产生大量的游离血红蛋白(FHb)，并且释放细胞内精氨酸酶。前者可与一氧化氮(NO)迅速结合，后者则可降解NO的合成底物L-精氨酸，加之溶血后活性氧簇(ROS)增加等因素，共同导致溶血性疾病患者体内的NO耗竭，并且进一步引发血管内皮损伤和微循环血管舒缩障碍，最终导致多器官的急、慢性损伤。近年，随着对血管内溶血过程中NO消耗机制的深入研究，相关疾病的常见病理损伤机制得以阐明，为NO的替代治疗开辟了一个崭新的途径。基于此，笔者拟就NO消耗机制及其替代治疗在血管内溶血性疾病中的研究进展进行综述。
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溶血性疾病按照溶血发生部位的不同，可分为血管内溶血和血管外溶血，前者红细胞破坏主要发生于血液循环系统，而后者主要发生于单核-巨噬细胞系统。对于血管内溶血，其典型特征为红细胞被直接破坏，并释放出大量的游离血红蛋白(free hemoglobin，FHb)和细胞内物质。其中，FHb可与一氧化氮(nitric oxide, NO)迅速且不可逆地结合，造成NO的大量消耗；而细胞内物质含精氨酸酶(arginase)，后者可分解NO的合成底物L-精氨酸，导致NO的合成减少。
NO是体内一种十分重要的小分子，可激活可溶性鸟苷酸环化酶(soluble guanylate cyclase，sGC)，增加细胞内环磷鸟苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)的含量，进一步活化cGMP依赖激酶，从而减少平滑肌细胞内的钙离子浓度，引起血管舒张、局部血流增加[1]。此外，NO还可抑制血小板活化、调节凝血因子活性，从而降低血栓形成风险[2,3]。
对于血管内溶血性疾病而言，除溶血本身导致的贫血外，随疾病进展发生的多器官损害，更是成为增加该类疾病患者负担的一个重要因素。然而，对于阵发性睡眠性血红蛋白尿症(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH)，镰状细胞性贫血(sickle cell disease，SCD)等血管内溶血性疾病，目前的治疗方法有限或者治疗费用高昂。因此，针对这类慢性疾病，除根治性的疗法外，其他可减少患者并发症、延长生存期的治疗方法亦值得进一步探索。基于此，NO消耗机制及其替代补充成为目前探索该类疾病新疗法的重要研究方向之一。
机体发生血管内溶血时，存在多种NO消耗机制。这些机制的共同参与，最终导致体内的NO处于持续性低水平状态。血管内溶血时NO的消耗机制主要包括以下3个方面。
非溶血条件下，由于细胞膜的屏障作用，细胞内血红蛋白(hemoglobin，Hb)基本不消耗血液循环中的NO。而血管内溶血时，红细胞破坏后释放出大量的FHb，FHb与NO迅速且不可逆地结合，二者的结合能力至少是NO与细胞内Hb结合能力的1 000倍[4]。因此，溶血发生时，NO可降低至几近耗竭的状态。近期研究还表明，结合珠蛋白可辅助NO的信号转导，而溶血时FHb与结合珠蛋白结合，导致其辅助NO信号转导的作用降低[5]。此外，在一项关于贮存红细胞的研究中发现，除FHb可消耗NO外，溶血时产生的红细胞微粒亦可消耗血液中的NO[6]。因此，溶血时产生的FHb既影响NO的数量，也影响NO的生物学活性和功能。
精氨酸酶是一种细胞内酶，可分解NO的合成底物L-精氨酸。血管内溶血时，精氨酸酶从红细胞内释放入血，大量分解L-精氨酸，造成NO合成底物减少，最终加剧体内NO的不足[7,8]。此外，血管内溶血时红细胞还释放非对称性二甲基精氨酸(asymmetric dimethyl arginine，ADMA)。ADMA是一种内源性的一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase，NOS)抑制物，ADMA可通过抑制NOS活性，从而导致NO的合成能力下降[9]。Kato等[10]研究结果显示，SCD患者(n＝177)的ADMA水平较健康个体(n＝29)显著升高(0.94 μmol/L比0.31 μmol/L，P<0.001)，并且其升高水平与溶血严重程度呈正相关关系，这提示SCD患者发生溶血过程中，其体内NO合成的前体物质，以及合成酶系统均受抑制。
对于血管内溶血性疾病患者，由于长期反复发生发作性溶血，红细胞破坏所释放出的氧化物血红素(heme)和铁可致活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)不断累积，体内氧化应激水平升高，造成细胞线粒体损伤和细胞膜结构的不稳定(磷脂酰丝氨酸外翻)，使机体处于一种慢性炎症状态；同时，由于机体的抗氧化应激能力减弱，NO的合成酶系统易遭受氧化损伤，导致NO的合成能力下降[11,12,13,14]。一项针对147例SCD患儿的研究发现，患儿体内的ROS及NO代谢产物水平明显高于健康个体对照组(n＝156)；而抗氧化物质，如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)，过氧化氢酶(catalase)和谷胱甘肽(glutathione，GSH)等水平却显著低于对照组(P<0.05)；同时，患儿体内的炎症因子水平亦较对照组显著升高(P<0.05)，提示SCD患儿体内存在高水平的氧化应激和炎症反应，这不仅可导致NO的合成酶体系受损，并且由于ROS导致细胞膜结构的不稳定，可进一步加重红细胞的破坏，释放出更多的FHb及细胞内物质，导致溶血-氧化应激-再溶血的恶性循环[15]。
NO消耗后，最直接的影响即为NO/cGMP信号通路的传导障碍，从而影响机体的一系列生理功能。此外，NO对机体还具有非信号分子的保护作用，其消耗可导致机体炎症发生和血栓形成风险增加。
内皮舒缩功能对于机体组织的血氧供应调节起着十分重要的作用，血管平滑肌细胞通过NO/cGMP信号通路调节自身的收缩与舒张[1]。血管内溶血时，机体NO的耗竭导致血管平滑肌细胞的舒张功能受限，导致组织缺血、缺氧状态难以改善。对于非血管性平滑肌，NO的缺乏同样会导致其舒缩功能障碍，如PNH患者发生溶血时，可出现吞咽不适。
Henrique等[16]通过对小鼠食管平滑肌收缩张力的研究发现，血管内溶血时，由于NO的消耗和氧化应激，小鼠的食管平滑肌处于持续的高张力状态；该研究进一步阐明了PNH患者的吞咽不适与NO/cGMP信号通路传导障碍之间的关系。2015年，Wuschek等[17]报道了1例左心室辅助装置导致溶血后继发吞咽困难的病例，该研究结果显示，该患者体内的NO水平低于正常参考值范围下限；而在溶血得到纠正后，NO水平得以恢复，同时患者的吞咽困难亦得到改善。
De Cobelli等[18]通过flow MRI技术研究PNH患者肠系膜的血流和灌注情况时发现，伴反复腹痛PNH患者其肠系膜血管的血流和灌注较不伴腹痛者明显减少[肠系膜血流灌注曲线下相对面积：(84.81±4.99)比(131.73±18.47)，P<0.001]，由于该研究纳入的研究对象已排除存在血栓形成风险者，故可推测PNH患者疼痛机制为溶血导致的NO耗竭，进而引起肠系膜血管收缩，并最终引发腹部缺血性疼痛。近期，Elias等[19]报道了2例以腹痛发病的PNH患者，通过各项检查均未能发现血栓、炎症等常见的腹痛原因，从PNH溶血消耗NO导致血管平滑肌收缩这一角度出发，或可推测该2例患者的腹痛亦有可能为缺血性疼痛。此外，对于溶血性贫血患者易合并的肺动脉高压，目前研究认为其具体机制为长期反复溶血消耗NO，导致肺动脉内皮舒张功能受损、肺动脉血压调节功能障碍[20,21]。
较高的血栓形成风险为慢性血管内溶血患者的临床特征之一。虽然该类患者的血栓形成并非由单一因素引起，但是NO的耗竭在此过程中发挥十分重要的作用。
NO可与血小板结合，下调血小板膜糖蛋白(glycoprotein，GP)Ⅱb/Ⅲa的表达水平，减少血小板与内皮细胞的黏附，并且降低促凝蛋白的分泌，从而发挥其抗血栓形成的作用[22]。NO损耗后，可活化血小板并增加细胞表面P-选择素的表达水平，引起血小板和内皮细胞，以及血小板和血小板之间的黏附和聚集，从而增加血管内溶血性疾病患者血栓形成的风险[2]。
另有研究结果证实，NO可调节凝血因子FⅩⅢ的功能，而NO的消耗可增加纤维蛋白分解产物及凝血-抗凝血复合物水平，降低血凝块的可溶解性，导致明显的纤维蛋白沉积和血栓形成[3]。此外，NO还可通过抑制白细胞与血管内皮的黏附、下调炎症因子的产生而发挥抗炎作用[23,24]。因此，对于反复发作的血管内溶血性疾病患者，其体内NO的消耗必然导致机体处于一种持续性的慢性炎症状态，并且成为血管内皮及其他组织器官的持续性损伤因素。
目前，关于NO替代治疗的研究主要集中于SCD和PNH，其他血管内溶血性疾病的研究相对较少。NO替代治疗主要包括直接补充NO、增加NO生成、减少NO消耗，以及直接活化NO的下游信号通路4个策略。
由于溶血性疾病患者发生血管内溶血时NO被直接消耗，因此直接补充NO成为最先探索的治疗方法。较为早期的病例报道提示，NO吸入制剂治疗SCD患者急性胸痛综合征(acute chest syndrome)具备安全性和有效性，其可能的机制为NO抑制镰状红细胞聚集和血小板活化，从而减轻患者的肺动脉高压，并且改善肺通气血流比[25,26,27]。2010年进行的一项双盲、随机对照试验纳入了18例发生血管阻塞性疼痛的患者，结果显示吸入NO组(n＝9)较安慰剂组(n＝9)患者的疼痛指数改善[视觉疼痛评分改善：(6.30±2.20)分比(2.97±2.10)分，P＝0.02]，阿片用量有所减少(P＝0.26)，并且研究过程中未发生吸入NO相关的不良反应[28]。但是，在随后进行的2项分别纳入150例和100例SCD患者的随机对照试验中，吸入NO治疗的有效性未能得到进一步证实[29,30]。
上述研究结果表明，吸入NO尚不能作为一种有效的治疗手段直接补充血管内溶血性疾病患者体内被消耗的NO，分析其原因可能为吸入NO的有效药物浓度无法长时间维持。因此，需进一步探索NO的剂型和给药方式。
虽然直接补充NO治疗血管内溶血性疾病患者未能获得满意的疗效，但是通过间接途径提高NO的生成在NO替代治疗中则显示出了较好的前景。目前，针对增加NO生成的研究主要集中于精氨酸治疗SCD患者的血管阻塞性疼痛。
2013年，一项纳入38例共发生56次急性疼痛危象SCD患儿的随机对照试验结果表明，口服精氨酸组(发生急性疼痛危象次数为28次，100 mg/kg，3次/d)较安慰剂组(发生急性疼痛危象次数为28次)患儿的阿片用量减少54%[(1.9±2.0)mg/kg比(4.1±4.1)mg/kg，P＝0.02]，并且疼痛评分更低[(1.9±2.4)分比(3.9±2.9)分，P＝0.01)][31]。2015年，Kehinde等[32]在28例SCD患者中进行的一项病例系列研究结果显示，口服低剂量L-精氨酸(1 g/d，连续给药6周)，可明显提高患者血浆NO水平，增加镰状红细胞对渗透破坏的抵抗能力，同时提高机体的抗氧化能力。目前，尚有2项临床试验(www.clinicaltrials.gov，NCT02447874、NCT02536170)在对静脉输注精氨酸治疗SCD患者血管阻塞性危象的有效性和安全性进行评估。精氨酸作为一种廉价、易制备的原料药，其制剂对于血管内溶血性疾病的治疗价值值得进一步探索。
此外，溶血时释放出的精氨酸酶可降解NO生成的底物精氨酸，因此抑制精氨酸酶亦成为增加NO生成的另一途径。Steppan等[33]采用精氨酸酶抑制剂2氨基-6-溴己酸抑制转基因SCD小鼠的精氨酸酶活性的研究结果表明，2氨基-6-溴己酸可显著提高小鼠体内NO的生物学活性，改善小鼠血管内皮细胞的功能障碍。但是目前精氨酸酶抑制剂用于增加NO的研究数量偏少，并且尚局限于动物研究阶段。
NO主要在溶血发作时被消耗，因此减少NO的消耗即意味着需减少溶血发作。对于PNH患者，已有补体抑制剂eculizumab应用于临床可以减少溶血的发生，并取得了不错的疗效。而新近一项在大鼠和猪中进行的研究通过补充珠蛋白及其类似物(PIT54)，以竞争性地结合血管内溶血时释放的FHb，使FHb对NO的消耗减少，从而保留NO信号的正常转导，最终改善了溶血时的血管收缩，并且降低了相应的心血管事件发生风险[5]。
NO的消耗导致NO/cGMP信号通路传导异常，而直接活化NO下游信号通路，则可减少NO消耗对机体带来的不良影响。Henrique等[16]研究结果显示，小鼠发生血管内溶血时，其食管平滑肌处于一种高张力状态，而给予一种非NO依赖的sGC激动剂(BAY 41-2272)直接活化NO的下游信号后，小鼠的食道平滑肌张力明显下降。
作为一种重要的信号分子，NO在调节血管内皮舒缩、抗血小板活化及抗炎等方面的作用，不仅为研究血管内溶血性疾病的发病机理提供了方向，更为溶血性疾病的治疗提供了新的靶点。随着对NO消耗与补充机制研究的逐渐深入，以及正在进行和即将开展的临床试验，将会有更多、更为有效的方法治疗血管内溶血性疾病的血栓、疼痛等并发症及慢性多器官损伤。同时，虽然NO消耗是血管内溶血性疾病的共有致病机制，但是不同疾病之间的溶血触发机制和后续病理损害依然存在一定的差异。因此，只有深入探索溶血性疾病的共性和特性，才能充分开拓NO在血管内溶血性疾病中的治疗价值。
所有作者均声明不存在利益冲突
