嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）免疫疗法在复发/难治性血液系统恶性肿瘤患者的治疗中备受重视。CAR-T免疫疗法的疗效受到多种因素的影响，包括CAR-T的制备、在体内的扩增和杀伤，以及疾病类型、疾病状态、治疗前预处理方案等。输注CAR-T前接受淋巴细胞清除等预处理方案，可以提高CAR-T免疫疗法的疗效。目前其常用预处理方案包括环磷酰胺、氟达拉滨、喷司他丁、苯达莫司汀、阿糖胞苷等化疗和全身放射疗法（TBI）等。但是，CAR-T预处理方案的最佳选择、最适宜剂量等，尚无明确结论。笔者对近年来CAR-T免疫疗法预处理方案的研究现状及相关研究进展进行综述，旨在寻求最佳预处理方案，提高CAR-T疗效。
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近年，过继性免疫治疗（adoptive cellular transfer immunotherapy，ACT）在血液系统恶性肿瘤治疗方面取得很大进展，特别是嵌合抗原受体修饰T细胞（chimeric antigen receptor modified T cells，CAR-T）免疫疗法。研究结果显示，CAR-T免疫疗法作为一种前景远大的新治疗方法，可通过靶向不同的抗原，而在急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL），慢性淋巴细胞白血病（chronic lymphocytic leukemia，CLL），多发性骨髓瘤（multiple myeloma ，MM），以及恶性淋巴瘤等血液系统恶性肿瘤中取得良好疗效[1,2]。CAR-T免疫疗法用于治疗复发/难治性急性B淋巴细胞白血病（B-cell acute lymphoblastic leukemia，B-ALL）患者的完全缓解（complete remission，CR）率超过90%，治疗CLL患者CR率为23%～50%，治疗B细胞性非霍奇金淋巴瘤（B cell non Hodgkin lymphoma，B-NHL）患者CR率为47%～100% [3]。
嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）分子是一类人工构建的融合蛋白，由3个主要组分构成：①来源于1个单克隆抗体单链可变区序列的胞外抗原结合区；②来源于CD3、CD4、CD8或CD28的跨膜连接区；③由CD3ζ单独或加入共刺激分子组成的胞内信号区[4]。编码CAR分子的DNA序列可通过慢病毒或逆转录病毒转导、电转染或转座子的形式稳定转入人类T细胞中。与生理性T细胞受体（T cell receptor ，TCR）不同，CAR-T识别和杀伤肿瘤细胞不依赖肿瘤细胞主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）分子提供共刺激信号，从而避免肿瘤细胞由于下调MHC分子而造成免疫逃逸的现象。由于CD19在B细胞发育的整个过程均表达，并且B细胞清除引起的临床不良反应相对可控，CD19成为CAR-T治疗B细胞肿瘤的理想靶点。目前研究表明，CD19-CAR-T免疫疗法治疗儿童和成年人ALL的CR率可达90%[5]。除CD19外，CD20[6]、CD22[7]、CD30[8]等作为靶点的CAR-T疗法正应用于多种其他血液系统恶性肿瘤的治疗。此外，大部分CAR-T均为自体制备，而也有部分临床研究在B-ALL、CLL及B-NHL患者中，应用异体T细胞制备的CAR-T[9]。
CAR-T免疫疗法的预处理，主要是通过细胞毒性的化疗或放疗，清除患者体内的淋巴细胞。其预处理的强度与输注CAR-T在患者体内的存活时间，与其疗效密切相关[10]。
目前，为探究CAR-T免疫疗法的最佳预处理方案，一系列临床研究聚焦于预处理方案的必要性、药物与剂量的选择，以及对后续不良反应的处理[11]。目前研究中常用的预处理药物包括环磷酰胺、氟达拉滨、喷司他丁[12]、苯达莫司汀[13]、阿糖胞苷[14]，亦有研究在CAR-T免疫疗法的预处理方案中使用全身放射疗法（total body irradiation，TBI）[15]。其中，环磷酰胺是最早及最为广泛使用的预处理药物。环磷酰胺作为一种具有免疫抑制性质的烷化剂，常用于治疗实体瘤，白血病，非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma，NHL），自身免疫性疾病和骨髓移植的预处理。在纤维肉瘤小鼠模型中，研究者发现在脾细胞过继性细胞免疫治疗前，使用环磷酰胺进行预处理，可减少调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）[16]。Cohen等[17]在使用B细胞成熟抗原（B-cell maturation antigen，BCMA）-CAR-T治疗难治性MM的临床研究中，比较使用环磷酰胺预处理者（n＝6）与未接受预处理者（n＝5）的临床疗效，结果显示，前者CAR-T-BCMA扩增峰值显著高于后者；CAR-T-BCMA扩增峰值的增高可能与患者获得部分缓解（partial remission，PR）及以上的临床疗效相关。
氟达拉滨则是一种核苷类似物，其作为CAR-T免疫疗法预处理方案的重要组成药物，已被成功用于CAR-T治疗的临床试验[18]。Turtle等[18]针对32例成年人复发/难治性NHL的CAR-T免疫治疗研究结果显示，联合使用氟达拉滨和环磷酰胺的预处理方案（n＝11），优于单独使用环磷酰胺的预处理方案（n＝20），其CR率分别为50%和8%，二者比较，差异有统计学意义（P<0.05）。该结果提示，与单独使用环磷酰胺相比，氟达拉滨＋环磷酰胺的强化预处理可提高患者体内CAR-T的存活时间，改善患者的疗效。研究者认为，氟达拉滨＋环磷酰胺预处理可促进患者体内T细胞增殖和存活的内源性细胞因子增加，抗CAR的单链抗体（single-chain variable fragment，scFv）的免疫反应减弱及肿瘤微环境改善，从而促进CAR-T发挥作用[18,19]。然而，2016年美国食品与药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）因3例患者脑水肿死亡事件，而紧急停止一项关于CD19-CAR-T免疫治疗B-ALL的中期临床试验（JCAR015），并认为CAR-T免疫治疗中增加的神经毒性与氟达拉滨的使用有关。因此，在采用含氟达拉滨预处理方案提高CAR-T免疫疗法临床疗效的同时，需要进一步关注其安全性。
除了被研究者熟知的化疗药物预处理外，TBI亦被应用于以CAR-T输注为代表的ACT前预处理手段[20]。研究结果显示，与未接受放疗组小鼠相比，CD19-CAR-T输注前使用放疗预处理小鼠的存活时间更长[21]。一项针对转移性黑色素瘤的临床试验中，纳入2组将接受过继细胞疗法的患者，1组患者（n＝43例）单独采用氟达拉滨＋环磷酰胺化疗进行预处理，另1组患者（n＝25例）采用化疗联合TBI进行预处理，结果显示，单独使用化疗预处理者的反应率达49%，而在化疗中接受2或12 Gy的TBI者的反应率分别可达52%和72%[22]。该结果表明，加用TBI可能增加CAR-T预处理的有效性，但是其疗效和安全性仍需进一步研究结果证实。
有研究结果显示，适当降低预处理剂量，可能在更低的毒性反应下获得相似的临床效果[23,24]。美国国家癌症研究所（National Cancer Institute，NCI）最早成功使用CD19-CAR-T免疫疗法治疗15例晚期B细胞恶性肿瘤患者的临床试验中，采用大剂量环磷酰胺＋氟达拉滨为预处理方案，结果显示，13例患者输注CD19-CAR-T后出现急性不良反应，包括发热、低血压及谵妄等神经毒性反应[23]。由于大剂量预处理化疗达到疾病缓解目的的同时，亦可发生严重不良反应。因此，目前研究者致力于尝试减低预处理方案的药物剂量。2017年NCI对22例B-NHL患者采用低剂量环磷酰胺＋氟达拉滨化疗联合CAR-T免疫疗法的研究结果显示，在输注CD19-CAR-T前使用低剂量环磷酰胺＋氟达拉滨进行预处理，可以清除患者体内淋巴细胞，增加血清白细胞介素（interleukin，IL）-15、-7等细胞因子水平，同时不良反应发生率较低[24]。该研究结果还显示，IL-15的峰值水平与血液中CAR-T峰值呈正相关关系（P＝0.001），并且二者均与PR，CR率增高呈正相关关系（P<0.001）[24]。而在CAR-T输注前，若不采用任何预处理手段，虽然不良反应发生率及其严重程度降低，但是疾病有效缓解率也随之降低[9]。
预处理方案的联合应用，可提高CAR-T免疫疗法的临床疗效[25,26]。Brentjens等[25]共计纳入10例ALL和CLL患者，并对在输注CD19-CAR-CD28z-T前1 d接受环磷酰胺1.5～3.0 g/m2预处理患者（n＝9）和未接受预处理者（n＝1）的疗效进行比较，结果显示，接受环磷酰胺预处理者较未接受预处理者显示出更强的CAR-T持久性及临床活性。该结果表明，预处理方案对CAR-T免疫疗法具有显著重要性。Zhang等[27]对131例复发/难治性B细胞恶性肿瘤患者（包括73例ALL、27例CLL和31例淋巴瘤患者）的临床资料进行Meta分析，并且对CAR-T输注前使用或不使用预处理方案患者的6个月无进展生存（progression-free survival，PFS）率进行比较，结果显示，CAR-T输注前使用预处理者PFS率达94.6%，显著高于后者的54.5%（P<0.001）。楼敬伟等[28]通过6 Gy TBI诱导小鼠淋巴细胞缺乏状态的研究结果显示，白血病特异性细胞毒性T细胞在淋巴细胞缺乏受体小鼠体内扩增速度较同时输注的脾T淋巴细胞更快，扩增倍数更高，并且具有显著增强的抗白血病作用。该结果提示，诱导受体淋巴细胞缺乏的预处理方案可显著增强外源性CAR-T的疗效。预处理方案提高CAR-T免疫疗法的治疗效果的可能机制包括其可清除患者体内内源性淋巴细胞，清除Treg，抑制吲哚胺2，3-双加氧酶（indoleamine-2，3-dioxygenase，IDO）的表达，降低患者体内肿瘤负荷，作用于肠道菌群，诱导免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death，ICD）和增强抗原呈递，以及通过放疗提高肿瘤细胞免疫原性。
患者体内的内源性淋巴细胞，不仅占据淋巴组织空间，并且可作为细胞因子池，消耗IL-7、-15、-21等促进T细胞活化增殖的前炎症细胞因子。因此，使用化疗或放疗清除淋巴细胞，可减少内源性淋巴细胞数量，使更多稳态细胞因子保留，并且增强CAR-T与IL-7、-15等促进增殖的细胞因子的接触，促进CAR-T的稳态增殖[29,30]。一项纳入15例B细胞恶性肿瘤患者的研究结果显示，预处理化疗5 d后IL-15、-7水平较化疗前分别增加13和2倍[15]。此外，一项使用抗体联合CD20-CAR-T治疗淋巴瘤小鼠模型的实验结果显示，采用抗体作为预处理方式，可清除体内表达CD20的正常B细胞，并且提高CAR-T杀伤肿瘤细胞的作用[31]。此外，该项研究中，清除淋巴细胞的同时还可能除去所谓的抗原池，由于抗原池可阻碍CAR-T定位到肿瘤处，并且可能导致正常B细胞引起CAR-T发生细胞失能或者凋亡。因此，清除抗原池即可逆转上述作用，使CAR-T发挥作用。
对异种移植模型小鼠的研究结果显示，Treg可以减弱CD19-CAR-T的抗癌效力[32]。Treg在维持人体对自身/肿瘤抗原的免疫耐受中发挥着重要作用，其可以抑制人体活化T细胞的增殖，并且抑制CAR-T杀伤肿瘤的作用。环磷酰胺等化疗药物通过去除Treg，以减少机体对效应T细胞抗肿瘤活性的抑制作用[23]，从而发挥CAR-T的治疗作用。
IDO是一种由肿瘤表达的细胞内酶，负责氨基酸色氨酸的代谢。增加色氨酸代谢物可以抑制T细胞增殖，促进T细胞死亡。CAR-T输注前使用的环磷酰胺和氟达拉滨，可以抑制小鼠B细胞恶性肿瘤中IDO的表达，从而降低色氨酸代谢，提高CAR-T增殖和活性[33]。
一项针对8例CLL患者的研究结果显示，治疗前患者外周血肿瘤负荷和CAR-T持续存在时间呈负相关关系（P＝0.003）[25]。这提示，体内肿瘤负荷较低的患者，若其CD 19抗原水平较低，则CAR-T治疗获得CR可能性也许更大。但上述结论，仍有待于进一步研究结果的证实。
有研究结果显示，采用TBI等预处理方案会诱导肠道菌群产物发生移位，激活固有免疫系统，从而触发Toll样受体4信号转导，增强CAR-T的杀伤作用[34]。因此，作用于肠道菌群的预处理方式，可以活化机体固有免疫系统，增强包括CAR-T在内的ACT的疗效。
Schiavoni等[35]研究发现，环磷酰胺等部分特定化疗药物可诱导免疫原性细胞死亡，刺激肿瘤特异性免疫，从而增强CAR-T免疫疗法的疗效。究其作用机制，可能如下。①环磷酰胺可引起CD8α＋树突状细胞（dendritic cell ，DC）的优先扩增，而DC是参与细胞衍生抗原交叉呈递的主要亚群；②环磷酰胺可诱导具有明确免疫原性的肿瘤细胞死亡。
临床前研究结果表明，放疗可通过多种途径提高肿瘤细胞的免疫原性[36,37]。①放疗使得肿瘤微环境更易受到免疫细胞的攻击[38]；②经局部放疗后，肿瘤抗原的表达增加[39]；③放疗可以诱导肿瘤内DC表达趋化因子，吸引免疫细胞进入肿瘤部位发挥抗肿瘤作用[40]；④ Fas（factor associated suicide），细胞间黏附分子（intercellular cell adhesion molecule，ICAM）-1和NKG2D（natural-killer group 2，member D）配体等在经放疗后的肿瘤细胞中表达上调[41]。因而，放疗作为预处理方案，可增强CAR-T的抗肿瘤效果。
CAR-T免疫疗法的预处理方案，会导致患者中性粒细胞和血小板数量减少，并且随着预处理药物剂量的加大，上述不良反应的严重程度和持续时间也会增加[24]。预处理中化疗方案不同，患者中性粒细胞减少的发生率亦不同，虽然未接受预处理者也可能发生中性粒细胞减少，但是研究发现，环磷酰胺＋氟达拉滨可造成88%患者的3级中性粒细胞减少和58%患者的4级中性粒细胞减少[42]。因此，对于患者接受CAR-T免疫疗法的预处理方案后可能发生的中性粒细胞数量减少，可在预处理方案后24 h开始预防性使用粒细胞集落刺激因子，并且持续至患者中性粒细胞恢复。
预处理中化疗方案的选择和剂量与CAR-T免疫疗法后患者的神经毒性反应的发生具有相关性。研究结果显示，大剂量氟达拉滨＋环磷酰胺方案后，淋巴瘤患者血清中IL-10、-15水平较化疗前更高，而发生3～4级神经毒性反应患者的血清IL-10、-15水平，显著高于发生<3级神经毒性反应者[24]。而未使用任何预处理方案，直接输注CAR-T的患者，神经毒性反应的发生罕见而微弱[9]。这提示，以化疗为预处理方案导致的IL-10、-15水平增高，除与疾病缓解有关外，也与神经毒性反应的发生有关。
接受以环磷酰胺等药物进行CAR-T免疫疗法预处理的患者，可能出现恶心、呕吐等不良反应。目前，临床上对该类患者的呕吐，常采用类固醇联用5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）3拮抗剂治疗，但是类固醇会抑制CAR-T的扩增，因此单独使用5-HT3拮抗剂缓解患者的呕吐症状可能更为适宜。此外，输注CAR-T后，应避免使用具有镇静作用的止吐药物，以免干扰对患者精神状态的评估。
目前，一系列动物实验和临床试验结果均证实，预处理方案的使用可提高CAR-T免疫疗法的疗效。其中，氟达拉滨＋环磷酰胺是CAR-T免疫疗法预处理方案中的最常见药物组合。但是，何种预处理方案以及何种药物剂量的临床效果最好，目前尚无明确结论。因此，相关研究者将会致力于进一步探索和优化预处理方案，以促进CAR-T的扩增和延长其体内存活时间，并且同时降低其不良反应的发生几率。为使更多患者有机会尝试CAR-T免疫疗法，一些研究者在不使用预处理的前提下，采用输注IL-7、改造CAR-T使其分泌IL-12等方式以达到增强CAR-T作用的目的，但是目前研究结果表明，上述方法仍无法取代预处理[26]。若将来有其他方法可以替代预处理，会使患者获得如下益处。①可以使更多一般状况较差、难以耐受预处理方案不良反应的患者，有机会尝试CAR-T免疫疗法；②预处理被替代后，可以避免患者由于监测和解决预处理方案所致不良反应的医疗费用的增加，减轻接受CAR-T免疫疗法患者的经济负担。
所有作者均声明不存在利益冲突
