急性髓细胞白血病(AML)是一种具有高度异质性的血液系统恶性肿瘤，大部分AML成年患者经治疗可达到完全缓解(CR)，然而相当一部分患者在3～5年内复发。由于微小残留病(MRD)与AML患者复发风险增加，以及生存期缩短有关，因此需要通过有效手段对AML患者进行治疗后MRD监测。多参数流式细胞术(MFC)是一种基于白血病相关免疫表型(LAIP)的MRD检测方法，具有高灵敏度、高性价比，以及实时、快速等优点，适用于绝大部分AML患者，被广泛应用于临床实践中。笔者拟就目前应用MFC监测AML患者MRD的原理及策略、优势及临床意义、面临的挑战及其临床应用的促进方法等进行综述。
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急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)在细胞遗传学、细胞形态学、免疫表型、分子生物学、基因表达特征，以及治疗反应等方面，均具有高度异质性[1]。目前，AML的主要治疗方案是以阿糖胞苷联合蒽环类药物为主的诱导治疗，以及以大剂量阿糖胞苷，造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)的巩固治疗。随着近年相关研究的进展，嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cells，CAR-T)免疫疗法，FMS样酪氨酸激酶(Fms-like tyrosine kinase，FLT)3抑制剂，异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase，IDH)抑制剂等方法的应用，使AML治疗取得新突破。约80% AML成年患者在接受强化化疗后，可获得完全缓解(complete remission，CR)，然而相当一部分患者最终复发，其5年总体生存(overall survival，OS)率仅为30%～40%[2]。微小残留病(minimal residual disease，MRD)是患者获得形态学CR后体内残存，而常规镜检无法检测到的低水平白血病细胞。研究表明，MRD水平与白血病复发密切相关，是AML患者的重要预后危险因素，可用于指导AML患者的CR后治疗[3]。因此，通过有效的手段检测MRD，早期识别具有高复发风险的患者，采取积极的干预措施，可以改善AML患者的临床结局。2017年欧洲白血病网(European Leukaemia Network，ELN)建议，对于不伴RUNX1T1、CBFB-MYH11、PML-RARA或NPM1等基因突变的AML患者，应通过多参数流式细胞术(multi-parameter flow cytometry，MFC)检测MRD进行预后评估[4]。笔者拟就目前AML患者中MFC-MRD的原理及分析策略、优势及临床意义、挑战及其临床应用促进方法等进行总结。
MFC-MRD是通过对血液或骨髓中单个细胞抗原表达量差异、细胞形态、大小、细胞质颗粒、核酸含量、各类胞内/胞膜蛋白及荧光特征等多参数进行评估，以快速区分细胞亚群，并列举产生亚群的相对大小，从而区分白血病细胞和正常细胞，应用于MRD检测的技术[5]。约90% AML患者在诊断时，白血病细胞表现出一种独特的抗原组合，其被称为白血病相关免疫表型(leukemia-associated immunophenotypes，LAIP)，这种LAIP是MFC- MRD的基础，可将白血病细胞与正常的髓系前体细胞和其他骨髓细胞进行区分。无论患者有无细胞遗传学及分子生物学异常，该方法均可适用，因此其覆盖面广泛，可对>90% AML患者进行MRD检测[6]。MFC-MRD主要通过2种部分重叠的分析策略检测免疫表型异常的白血病细胞，一种是基于AML患者初次诊断时检测的LAIP，另一种是基于识别任何区别于正常标本的免疫表型(different from-normal，DFN)，ELN的MRD工作组建议将上述2种方法的优点相结合，可以监测缺乏诊断时信息的AML患者，并且允许在随访时发现新的异常免疫表型，验证新出现的异常免疫表型对患者预后的影响[7]。国内研究显示，AML中存在CD34＋/CD38－/CDl23＋的白血病干细胞(leukemia stem cell，LSC)，其与白血病细胞在流式细胞图中的相对位置一致，并且化疗后LSC的比例较化疗前下降[8]。虽然MFC-MRD具有较强的预后价值，但仍有部分MRD阴性患者复发。越来越多的证据表明，LSC比大部分白血病细胞更具治疗耐药性，并且是白血病进展和复发的基础，而LSC阴性者较LSC阳性者预后更好，因此联合应用LSC-MRD与MFC-MRD，在治疗过程中连续监测LSC的总负荷，更有利于患者的预后判断[9]。将MFC检测AML患者MRD的结果应用于临床实践，需要注意MRD阴性值及不确定的中间值的分析，监测时间点的选择，以及MRD与复发的相关性。
通常将0.1%作为MRD检测的阈值，MRD阳性结果通常提示AML患者预后较差，而MRD<0.1%的阴性结果，则提示AML患者具有更高的生存率及更低的复发风险。在MFC-MRD阴性的检测报告中，可以添加MRD<0.01%或者无MFC-MRD识别等项目，以指导临床识别预后更好的AML患者。此外，一些AML患者的白血病细胞免疫表型可出现不同于正常髓系前体细胞的轻度改变，其MFC检测结果虽然不符合MRD阳性标准，但是该不典型表型可能在其随后标本中持续存在，提示对该类患者需要进行更为密切的随访[10]。
目前，临床上应用最广泛的2种MRD检测方法为PCR技术和MFC。PCR技术主要检测白血病相关基因异常，如融合基因、基因突变及基因过表达等，仅适用于一部分具有特异性分子生物学异常的患者。MFC对MRD的检测灵敏度低于PCR技术，但是其适用范围更广。相较于二代基因测序(next generation sequencing，NGS)，数字PCR等新技术，MFC-MRD费用更少，运行周期更短[15]。MFC检测方法不仅能准确定量检测AML患者的残留白血病细胞数，还可以进一步分析残留白血病细胞增殖、凋亡及耐药等生物学特性，识别潜在治疗靶点，具有检测LSC表型的潜力[7]。因此，MFC作为一种实时、快速、可定量、高灵敏度、高性价比、具有实验室广泛使用性的MRD检测技术，具有很高的临床应用价值[16]，可被认为是AML患者MRD的理想检测方法。
MRD阳性的AML患者较阴性者具有更高的复发风险及更低的生存率，需要采取积极的干预措施改善其预后，预防复发。而MRD阴性患者则拥有相对更好的预后。随着MFC-MRD的广泛应用，传统CR定义已经无法完全适用于AML患者的临床决策，根据MFC-MRD的评估标准，或许可以将AML患者CR的定义调整为MRD<0.1%甚至0.01%，以更精准地指导AML患者的预后分层[17]。张莹等[18]应用MFC对230例正常核型且不伴有NPM1突变、CEBPA双等位突变和FLT3基因内部串联重复突变的AML患者在巩固治疗前进行MRD检测的研究发现，患者巩固治疗前的MRD检测可早期预测其预后。该研究者将诱导化疗1个疗程获得形态学无白血病状态(morpho-logic leukemia.free state，MLFS)定义为早期缓解，结果显示，MLFS时MRD阴性组(n＝85)和MRD阳性组(n＝39)例患者的5年累积复发率、无复发生存率和OS率分别为9.1%和23.7%(P＝0.004)、52.3%和34.0%(P＝0.011)，以及55.6%和36.3%(P＝0.022)，这提示早期获得MRD阴性者预后良好，而MRD阳性者即使接受移植，仍具有较高复发风险。
Sui等[19]研究纳入292例AML患者，共鉴定出36种LAIP，每个LAIP基线水平被视为MRD评估的个体阈值，任何高于基线水平的可测量MRD，均被视为个体MRD阳性，将以0.1%作为阈值和以个体LAIP基线水平作为阈值的MRD状态分别称为0.1% MRD和个体MRD，该研究进行的多因素分析结果显示，第1、2次巩固治疗后以及CR后的个体MRD状态对患者的预后具有独立预测价值；与0.1% MRD阴性者相比，MRD阴性患者按个体阈值分层时，个体MRD阴性者的OS和无事件生存(event-free survival，EFS)均改善[3年OS率：90.2%(95%CI：79.6%～100.0%)比65.6%(95%CI：52.3%～78.9%)，P＝0.003；3年EFS率：72.9%(95%CI：56.6%～89.2%)比44.6%(95%CI：31.1%～58.1%)，P＝ 0.001]，而在仅接受化疗的低危或中危组患者中，个体MRD阴性者与接受异基因HSCT(allogeneic HSCT，allo-HSCT)患者预后相似，3年OS率、EFS率分别比较，差异均无统计学意义(P＝0.941、0.611)。采用上述个体化MRD进行预后评估，可以识别MRD为0.1%至状态不能区分的中、低危AML患者中，临床结局较好的患者，并对指导其个体化治疗具有重要意义。
通过MFC-MRD常可在较短时间内获得MRD检测结果，适用于90%以上AML患者。该方法可以动态、近乎实时地评估治疗效果，指导AML患者治疗方案的选择，判断患者是否需要接受进一步强化治疗，从而预防复发，或者提示应对患者进行更加密切随访。
研究表明，在allo-HSCT前的MRD结果，是AML患者移植后临床结局的独立预测因子[20]。通过对诱导及巩固治疗期间患者MRD水平的监测，可以判断AML患者是否需要进行allo-HSCT，并且预测其预后。移植前MRD阳性的AML患者具有较高复发风险，因此对于这部分患者，需要进行积极干预，如移植前化疗、强化预处理方案、减少免疫抑制药物的使用等。巩固治疗后MRD阳性的患者若进行allo-HSCT，则较仅接受化疗者复发风险降低，而是否能改善AML患者的OS及无病生存，仍需要更多相关研究结果证实[21]。Liu等[22]研究结果表明，AML患者移植前MRD持续阳性较单个时间点的MRD阳性，对其进行同胞全相合移植(matched sibling donor transplantation，MSDT)和单倍体移植(haploidentical stem cell transplantations，Haplo-SCT)的预后判断更为可靠，多因素分析结果显示，移植前MRD持续阳性与较高的累积复发率相关(HR＝1.69，95%CI：1.200～2.382，P＝0.003)。此外，AML老年患者通常具有老龄及一般状况较差等因素，被认为不适合进行allo-HSCT，但是由于其复发率较高，因此MRD检测结果阴性者可能更受益于HSCT，而非化疗[23]。
通过MFC可以对大部分AML患者进行MRD评估，但是迄今为止尚未达到定性或定量标准化，各实验室间监测结果不具可比性，关于MRD的阈值及监测时间点的选择仍存在争议。Terwijn等[25]对471例AML患者在第1、2次诱导治疗后和巩固治疗后的MRD数据分析结果显示，当MRD阈值分别为0.05%～0.8%、0.04%和0.01%～0.1%时，MRD阴性和阳性AML患者的复发率分别比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。MFC-MRD是基于LAIP的检测方法，考虑到疾病异质性，不同的LAIP基线表达水平存在差异，这表明选择某1个特定阈值判断所有LAIP的方法，可能不够准确[19]。移植前MFC-MRD阈值应选择可以将患者移植后复发风险类别区分良好的最佳临界值，还是使用MRD分析的技术检测限，有待进一步确认。Walter等[26]对第1、2次获得CR的AML患者进行allo-HSCT前骨髓标本分析，以0.1%为阈值，在MRD阳性患者中，MRD水平升高与复发和死亡风险增加无明显相关性。移植前即使最低水平的MRD存在，也与患者不良预后相关。此外，无法耐受强化化疗，常规化疗效果不佳，低强度治疗方案(地西他滨等)与传统药物在作用机制和反应动力学方面的不同，以及年龄相关性疾病的生物学差异等因素，使AML老年患者的MRD监测具有不确定性[27]。
对于MFC-MRD的结果分析具有较高专业性，分析人员对识别LAIP和LSC异常标志物等过程的结果判断不可避免地存在一定主观性。此外，由于MFC-MRD检测获得数据过于庞大，因此人工解释费时并且难度较大。初诊时的LAIP检测通常不能覆盖全部的抗原，AML患者复发时的免疫表型较初诊时可出现转换(亦被称为"抗原漂移")，新标志物的出现或者原有标志物的消失，均可能导致MFC-MRD结果的误判。LAIP的类型和数量，亦可能影响MFC-MRD结果的判断。反应性异常分化或克隆性造血，可能会导致MRD呈假阳性。根据免疫表型判断MRD阴性，并不能确保白血病细胞不存在；由于非成熟单核细胞常不表达CD34、CD117等未成熟的细胞标志物，并且缺乏单核细胞标志物CD14的表达，因此AML-M5患者的MRD检测结果评估，具有一定挑战性[28]。
MFC是一种检测AML患者MRD的理想方法，但是其在临床实践中面临诸多挑战。通过以下几个方法，可进一步促进MFC-MRD的临床应用。
目前，临床应用较多的MFC-MRD检测仪器为8色流式细胞仪，其检测MRD的敏感度有限，并且存在一定假阴性率。10色流式细胞仪不仅可以提供普通白细胞亚群的参考信息，也可以提供罕见白细胞亚群的参考信息，如非经典单核细胞，CD4＋、CD8＋双阳性T细胞(double positive T-cell，DPT)和调节性T细胞(regulatory T cells，Treg)等。因此，具有高灵敏度的10色流式细胞仪的临床推广、应用，将进一步提高MFC-MRD检测的敏感度，降低假阴性率，为AML患者的病情监测，提供可靠的依据[29,30]。
MFC可联合PCR和NGS等分子学方法检测MRD。在AML治疗早期，使用MFC和(或)PCR可相对快速地提供MRD检测结果，从而帮助临床医师在疾病早期评估中快速做出临床决策。在AML治疗后期，NGS等高灵敏度的检测方法可以用于减少MFC-MRD检测中的假阴性结果。因此，通过不同时间截点、不同MRD检测方法的组合应用，可以达到病情评估的最佳效应[31]。
相对于骨髓MFC-MRD，外周血MFC-MRD灵敏度较低而特异度较高。目前，临床上通常使用骨髓进行MFC-MRD监测，优化使用更容易获取的外周血标本进行MFC-MRD，可以提高AML患者的耐受性，有利于治疗后MRD的监测与随访。微流体技术是一种检测AML患者MRD的新技术，可通过外周血标本检测外周循环中白血病细胞，不仅灵敏度较高，并且与传统外周血MRD检测方法相比，可以更早发现疾病复发迹象，未来或许可将微流体技术与MFC相结合，实现微创式的AML患者MRD精准监测[32]。
通过标准化流程的多中心协作建立正常髓细胞LAIP的协作数据库，或许有助于使用LAIP确定AML患者MRD的最佳诊断截点。采用该方法，MFC-MRD检测的敏感度和特异度亦可能获得提高[33]。
研究表明，人工智能(artificial intelligence，AI)有助于MFC的重复分析或复杂分析，并且具有整合分析其他临床试验的能力。针对MFC-MRD分析中LAIP和LSC异常标志物的识别等程序中，存在一定主观性，以及人工数据分析与处理方面存在的问题，AI及相关计算机软件的开发，有助于降低MFC-MRD分析的主观性，减轻实验室分析人员的工作负担，从而提高临床MFC-MRD的分析效率。这可能成为MRD检测中自动化分析MFC的有力工具[34]。
尽管目前MFC-MRD临床应用中的LAIP选择、实验流程、阈值及监测时间点的选择尚缺乏统一的标准，其自身灵敏度的限制，以及检测过程中易发生"抗原漂移"等问题，也函待进一步解决。MFC-MRD在AML患者的治疗后监测和临床决策中起着非常重要的作用，MFC-MRD可以帮助判断患者的预后及复发风险，更好进行预后分层，近乎实时地指导治疗方案的选择，帮助判断患者进行HSCT的时机，调整低复发风险患者的治疗强度，对于高复发风险的患者及时进行干预。新技术的发展与应用，将推动AML患者MFC-MRD的标准化流程及个体化的风险评估及治疗，使用MFC-MRD将在AML患者的治疗后预后分层以及早期干预等方面发挥重要作用。
所有作者均声明不存在利益冲突
