调节性T细胞(Treg)是机体维持免疫耐受不可或缺的T细胞亚群。Treg数量和功能的异常可以导致机体发生自身免疫反应，从而对自身稳态产生破坏。活化T细胞核因子(NFAT)、B淋巴细胞诱导成熟蛋白(BLIMP)-1、干扰素调节因子(IRF)4等转录因子在T细胞的生长、发育中，发挥重要调控作用。NFAT、BLIMP-1、IRF4对Treg的发育和功能亦具有重要作用。笔者拟就NFAT、BLIMP-1、IRF4对Treg的调控及其可能的作用机制的最新研究进展进行阐述。
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调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)是介导免疫抑制的主要T细胞群，可以通过抑制自身反应性淋巴细胞的扩增负向调控抗原介导的免疫反应，避免自身免疫发生，从而在多种免疫性疾病的病理过程，以及肿瘤清除的抑制机制中发挥重要作用。叉头框转录因子(forkhead transcription factor，Foxp)3是Treg的特异性转录因子，其表达缺陷可导致Treg的生长发育缺陷，以及功能失调[1]。根据发育途径的不同，Treg可以分为由胸腺细胞发育而来的天然Treg(natural Treg，nTreg)和在外周通过转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β或白细胞介素(interleukin，IL)-10诱导分化的诱导性Treg(induced or inducible Treg，iTreg)[2]。此外，根据功能状态的不同，Treg还可以分为中央型Treg(central Treg cell，cTreg)和效应性Treg(effector Treg，eTreg)，前者处于静息状态，而后者处于活化状态，并且是Treg发挥免疫抑制功能的主要群体[3]。
Treg发挥免疫抑制功能的作用途径有多种，包括①分泌抑制性细胞因子IL-10、IL-35和TGF-β，发挥直接抑制作用；②分泌穿孔素和颗粒酶，发挥其介导的细胞毒性作用；③通过组成性高表达CD25竞争并消耗T细胞活化生长因子IL-2，表达CD39和CD73，促进细胞周围腺苷产生从而激活腺苷受体介导ATP失活，产生抑制性第二信使环磷酸腺苷(cyclic AMP，cAMP)；④上调细胞毒性T淋巴细胞抗原(cytotoxic T lymphocyte antigen，CTLA)-4表达，CTLA-4结合抗原提呈细胞(antigen presenting cell, APC)上的CD80/CD86配体，竞争性抑制了T细胞表面表达的共刺激分子CD28与CD80/CD86的结合，进而影响APC细胞对T细胞的激活作用；⑤表达淋巴细胞激活基因(lymphocyte-activation gene，LAG)-3与APC上的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)-Ⅱ类分子结合，从而抑制APC的抗原提呈功能[4]。
目前，Treg作用机制的相关研究已越来越多，然而其上游调控机制尚未完全明确。活化T细胞核因子(activated T cell nuclear factor，NFAT)通过与其他转录因子协同作用，可以启动和维持T细胞生长和功能相关的转录程序[5]。B淋巴细胞诱导成熟蛋白(B lymphocyte induced maturation protein，BLIMP)-1可由IL-2诱导，在各类T淋巴细胞中表达，并且调控T细胞的增殖和凋亡[6]。干扰素调节因子(interferon regulatory factor，IRF)4是淋巴细胞限制性IRF家族成员，仅在T细胞、B细胞等免疫细胞中表达，在T细胞中可以诱导细胞分化和调节免疫功能[7]。近年来，越来越多的学者认为NFAT、BLIMP-1、IRF4是调控T细胞发育和功能的重要转录因子，在Treg的调控中亦具有重要作用。笔者拟就这些分子调控Treg的研究进展进行阐述。
NFAT是T细胞中主要的刺激反应性DNA结合因子和转录调节因子[5]。T细胞受体(T cell receptor，TCR)信号刺激下游的钙信号激活NFAT家族蛋白，共刺激分子CD28提供第二信号激活转录激活因子激活蛋白(activator protein-1，AP)-1(Fos和Jun组成的二聚体)，NFAT和AP-1形成NFAT/AP-1转录复合物，该复合物结合T细胞活化相关靶基因的DNA，形成NFAT/AP-1/DNA复合元件，以诱导靶基因的表达，从而促进T细胞的分化[5,8]。在幼稚T细胞中，NFAT/AP-1转录复合物诱导IL2基因和IL-2受体(interleukin-2 receptor，IL-2R)α(CD25)基因表达，IL-2通过自分泌或旁分泌方式与T细胞上的IL-2R结合，并且通过Janus激酶(Janus kinase, JAK)/信号转导和转录激活因子(signal transducer and activators of transcription，STAT)信号通路激活STAT5，随后介导T细胞活化与增殖[9]。另外，NFAT/AP-1转录复合物还可以通过与其他因子协同作用，调节不同亚群T细胞的谱系特异转录因子的表达，如表达于T淋巴细胞上的T盒(T box expressed in T cell, T-bet)，GATA结合蛋白(GATA binding protein，GATA)3，维甲酸相关孤核受体(retinoic acid-related orphan receptor, ROR)γt和Foxp3等，从而分别诱导初始T细胞分化为辅助性T细胞(helper T cell , Th)1，Th2，Th17和Treg细胞[9]。NFAT对T细胞免疫耐受的维持，主要体现在对Treg的调控，NFAT可以调控Treg的分化，还可以与Foxp3形成转录复合物调控Treg中各基因的表达。
Foxp3是Treg的关键谱系特异性标志物，Foxp3的正常表达和维持是Treg分化和功能正常的重要前提。目前已有研究证实，NFAT在诱导和维持iTreg中Foxp3的表达具有重要作用[10,11]。Tone等[11]通过染色质免疫沉淀法(chromatin immunoprecipitation, ChIP)测定发现，相比未受TGF-β刺激的小鼠CD4＋CD25－T细胞，用TGF-β诱导分化小鼠CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg的Foxp3基因中，5′增强子区域的组蛋白H4分子高度乙酰化，并且通过电泳迁移率测定(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)验证出在上述诱导分化后的Treg中，NFAT与Foxp3基因5′增强子区域结合。然而，当Foxp3基因增强子区域中的NFAT结合位点发生突变或者使用NFAT抑制剂时，Foxp3基因5′增强子活性明显降低，并且该区域的组蛋白H4分子乙酰化水平下降。因此，NFAT对于Foxp3基因5′增强子的功能和组蛋白乙酰化是必需的转录因子，并可由此诱导和维持Foxp3基因表达。NFAT与Foxp3基因的内含子区保守的非编码序列(conserved non-coding sequence，CNS)1的相互作用，进一步支持NFAT对Treg分化的重要作用。Vaeth等[10]对ChIP测定结果显示，经TGF-β刺激后的初始CD4＋T细胞中可以观察到NFAT2与Foxp3基因的内含子区CNS1特异性结合，而在NFAT2缺陷小鼠中，TGF-β刺激下的CD4＋T细胞的Foxp3表达降低，使初始CD4＋T细胞诱导分化的iTreg显著减少。上述研究表明，NFAT是iTreg分化的必需因子，然而，NFAT在nTreg发育中的作用，仍存在争议。Tone等[11]发现，小鼠iTreg和nTreg中，NFAT与SMAD3和Foxp3结合区域的组蛋白H4分子均高度乙酰化。因此，该研究者提出，NFAT对调节nTreg发育也具有重要作用[11]。相反，Vaeth等[10]则发现，在胸腺、脾和淋巴结的CD4＋T细胞群中，Foxp3＋ CD25＋ nTreg的比例不受任何单独或组合NFAT成员缺乏的影响，这提示NFAT对于nTreg的发育并非必需[10]。
NFAT可以与Foxp3形成NFAT/Foxp3复合物，调节Treg功能相关基因的转录和表达。在Treg中，NFAT/Foxp3复合物可以与CTLA4、CD25基因的启动子结合，从而上调CTLA4和CD25基因的表达[12]。对NFAT/Foxp3结合界面的NFAT残基进行编辑，可影响NFAT与Foxp3的相互作用，破坏NFAT/Foxp3结合界面的完整性，导致IL2基因表达上调，CTLA4和CD25基因表达下调，并可诱导小鼠发生自身免疫性糖尿病等疾病[13]。使用Foxp3抑制剂，能够抑制Foxp3/NFAT相互作用，可在体外损害Treg对效应T细胞的抑制功能，并且导致Treg细胞中IL10基因和CTLA4基因的表达下调[12]。这进一步说明，NFAT对Treg功能成熟具有重要调控作用。
IL-2启动子抗原受体反应元件(antigen-receptor response element, ARRE)2是NFAT/AP-1的复合位点，该位点中的AP-1结合序列类似于叉头框蛋白的共有结合位点，但叉头框结构域直接与ARRE2复合位点结合的亲和力较弱。然而，当Foxp3与NFAT的DNA结合域Rel同源区(Rel homology region, RHR)形成协同复合物后，明显增强了Foxp3上叉头框结构域与IL2 DNA的ARRE2位点的亲和力，最终形成NFAT/Foxp3/DNA三元复合物，该复合物可竞争性抑制NFAT/AP-1转录复合物的活性，进而抑制IL2基因的转录[13]。IL-2是维持Treg存活和效应T细胞分化所必需的关键因子，其主要由CD4＋Th细胞、CD8＋T细胞等细胞产生。当T细胞中Foxp3基因表达上调并分化为Treg后，NFAT与Foxp3结合抑制了NFAT/AP-1转录复合物促进IL2基因转录的活性，导致Treg细胞无法分泌IL-2。总之，Treg的维持需要IL-2的刺激，而Treg本身不能分泌IL-2。因此，Treg在一定程度上消耗效应T细胞分化所需的IL-2，进而有效抑制效应T细胞的过度分化，以及减少过多IL-2引起的致炎效应。
BLIMP-1是由Prdm1基因编码的一种转录抑制因子[14]。在B细胞谱中，BLIMP-1是B细胞终末分化为可分泌抗体的浆细胞的主要调节因子[14]。在T细胞谱中，初始T细胞低表达BLIMP-1，而记忆性T细胞、效应性T细胞和Treg高表达BLIMP-1。在体外，通过TCR和IL-2刺激可以激活初始CD4＋T细胞，并且诱导BLIMP-1蛋白高表达[15]。IL-2是BLIMP-1的强诱导剂，IL-2与T细胞表面的IL-2R结合后，激活细胞内JAK/STAT信号通路，使其下游STAT5磷酸化后，介导Prdm1基因转录和BLIMP-1蛋白表达，而BLIMP-1可反向抑制IL2基因转录或抑制IL2基因的转录激活因子Fos的作用，从而减少IL-2的产生，以减弱T细胞的增殖和生存[15]。近年来，越来越多学者对BLIMP-1在Treg中的重要调节作用进行探索，并且认为BLIMP-1是介导Treg效应分化和功能成熟的重要分子。
与其他表达BLIMP-1的T细胞亚群相似，Treg中BLIMP-1的表达同样主要由IL-2/STAT5信号通路诱导[6]。BLIMP-1主要在成熟的eTreg中表达，Blimp-1＋ Treg高表达直接参与免疫抑制功能的分子，包括诱导型共刺激因子(inducible co-stimulator，ICOS)，抑制性受体CTLA-4，抗炎细胞因子IL-10[16]。BLIMP-1对Treg产生IL-10具有必需性，Blimp1基因缺陷小鼠的Treg中，IL10基因的表达几乎完全丧失[16]。因此，BLIMP-1对于Treg效应表型的分化和效应功能的发挥具有重要作用。
目前，在Foxp3基因座上发现4个保守的CNS，分别为CNS0～3，其中CNS2是Treg特异性去甲基化区域，含有仅在eTreg中的高度去甲基化的CpG岛[2]。虽然CNS2的缺陷不改变胸腺细胞的Treg生成，但降低Treg增殖过程中Foxp3基因的稳定性[2]。在炎症状态下，IL-6/STAT3信号通路激活Treg中的DNA甲基转移酶(DNA-methyltranferase，DNMT)3a，该酶使Foxp3基因的CNS2基因座的CpG岛发生甲基化并下调Foxp3基因的表达[17]。正常的eTreg高表达BLIMP-1，而BLIMP-1可以与STAT3或Dnmt3a基因位点结合，以抑制Dnmt3a基因表达，进而拮抗该酶诱导CNS2基因座甲基化的作用，维持Foxp3表型[17]。因此，BLIMP-1对于CNS2的去甲基化修饰，以及Treg Foxp3表型的维持至关重要。
IRF家族是一组与基因表达和免疫应答调节相关的转录因子[18]。IRF4是IRF转录因子家族中的淋巴细胞限制性成员，仅在免疫系统细胞中表达，主要调节T细胞、B细胞和浆细胞的成熟，效应T细胞的分化以及Treg的功能[7]。IRF4主要通过与不同转录因子或特定启动子上的DNA结合域(DNA-binding domain，DBD)相互作用发挥转录激活或抑制作用，IFR4基因缺陷会造成一定程度免疫缺陷，免疫细胞发育及激活受阻[7]。
在T细胞中，TCR信号是IRF4诱导的主要途径，因此IRF4在所有已知的T细胞亚群中表达[19,20]。TCR信号刺激后几小时内诱导T细胞高表达IRF4，而在缺乏TCR信号刺激的情况下，IRF4基因表达下调，因此IRF4基因表达依赖于TCR信号的持续刺激[20]。核因子-κB家族成员c-Rel是调控IRF4的重要上游分子，免疫沉淀实验结果显示，IRF4可与c-Rel特异性结合，而且在c-Rel-/-淋巴细胞中，IRF4基因表达几乎缺失[19,21,22]。IRF4基因表达还依赖于IL-2诱导型T细胞激酶(IL-2-inducible T cell kinase，ITK)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)信号通路的活性，使用ITK和mTOR抑制剂可以协同抑制IRF4基因表达，由此表明，上述2种信号通路协同影响IRF4基因表达[23]。另外研究发现，Foxp3特异性敲低可导致IRF4 mRNA显著减少，因此，Foxp3可能可以直接调节Treg中IRF4基因的表达[24]。
TCR信号刺激后，IRF4基因表达快速上调，随后控制幼稚CD4＋T细胞分化成具有特异性效应功能和细胞因子谱特征的不同亚群[19]。由于IRF4基因敲除小鼠中的Foxp3＋ Treg较野生型小鼠中无明显减少[24]，提示IRF4并非产生Treg所必需的调节因子。然而，IRF4在Treg分化为eTreg中发挥重要作用。Zheng等[24]研究发现，IRF4基因缺陷小鼠与野生型小鼠相比，Foxp3＋ Treg数量不减反增，但最终发展却自身免疫性疾病；经检测IRF4-/- Treg中，提示活化状态和抑制活性的ICOS和IL10基因表达严重减少。Xu等[7]使用ICOS作为模型基因结合IRF4和Foxp3，结果显示，IRF4与Foxp3结合形成转录复合物共同与ICOS基因的启动子结合，从而影响靶基因ICOS的表达。IRF4基因缺陷的Treg BLIMP-1表达缺乏，并且无法分化为eTreg，表明IRF4在eTreg分化中作用于BLIMP-1的上游[7,25]。
DEF6蛋白及其同源蛋白指开关相关蛋白(switch-associated protein，SWAP)-70均可通过与IRF4相互作用，并且选择性抑制IRF4与靶基因结合的能力。Chandrasekaran等[26]发现IRF4-/-小鼠Treg数量减少，eTreg标志物ICOS，糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor，GITR)，CD103，趋化因子受体(chemokine receptor, CCR)6等表达降低；DEF6和SWAP-70双敲除(double-knockout, DKO)小鼠中，外周eTreg显著扩增，ICOS、CITR、CD103、CCR6等活化标志物的表达水平随之上升，同时BLIMP-1表达水平上调并促使IL-10产生增多；然而，在该DKO小鼠的基础上再敲除IRF4基因后，DEF6和SWAP70缺陷导致的eTreg扩增发生反转，IRF4-/- DKO小鼠中Treg显著减少，并且ICOS、CITR、CD103、CCR6等活化标志物表达缺陷[26]。因此，IRF4作为eTreg分化的重要分子，其对Treg的作用受DEF6和SWAP-70的调控。
综上所述，IRF4对于eTreg的分化和IL-10的产生，具有十分重要的作用，其可以通过与Foxp3形成复合物协同作用调节Treg的特异性转录程序，也可以通过激活下游Blimp-1，诱导eTreg中IL-10的产生。IRF4在Treg中的活性，在一定程度上受到DEF6和SWAP-70的调控，但其具体机制仍需进一步探索。
Treg通过抑制效应性T细胞的过度增殖和活化，在机体外周免疫耐受的维持中发挥关键作用。NFAT、BLIMP-1、IRF4等分子在各T细胞亚群的分化和发育中发挥不同功能，对维持T细胞活化和抑制的平衡起重要作用。对于Treg，上述分子可以通过转录调节Treg发育和功能相关的基因，调控Treg的分化发育和功能成熟。第一，NFAT与Foxp3结合有效介导Foxp3 5′增强子区域组蛋白H4乙酰化，而且NFAT/Foxp3复合物可以竞争性抑制NFAT/AP-1转录复合物的形成，从而有效抑制Treg中IL-2的产生，同时还可以上调CTLA-4和CD25等功能分子的表达。第二，Treg高表达BLIMP-1，BLIMP-1可以通过拮抗STAT3和DNMT3A对Foxp3基因中CNS2基因座的促甲基化作用，从而维持Foxp3基因的稳定表达，也间接稳固了NFAT/Foxp3复合物对IL-2的抑制作用。BLIMP-1还可以激活Treg中IL10基因，促进IL-10的产生，从而诱导eTreg的分化，并且介导Treg的抑制功能。第三，IRF4是Treg活化和效应表型分化的关键因子。IRF4与Foxp3形成复合物后结合ICOS的启动子，从而调控Treg向eTreg分化，并上调ICOS、CTLA-4、IL-10等功能分子的表达。
综上所述，NFAT、BLIMP1、IFR4均可通过调控Treg相关基因的转录和表达维持Treg的稳态，其表达异常可能作为Treg异常介导的各类疾病的关键因素。研究这些转录因子可能为免疫调节和免疫干预提供新思路，并可能在Treg相关疾病的诊治产生广泛应用前景。
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