红细胞是重要的血液组成成分，其在健康成年人体内主要由骨髓产生，通过参与O2和CO2运输，维持机体正常生理活动。红细胞生成涉及复杂的调控网络，其中转录调控对于红细胞生成至关重要，对红系谱系确立、红细胞分化、成熟，以及血红蛋白(Hb)生成等，均发挥重要作用。此过程涉及GATA转录因子、Kruppel样转录因子(KLF)及叉头转录因子等多种重要转录因子。笔者拟就上述转录因子在红细胞生成中的调控机制的研究进展进行综述。
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红细胞是重要的血液成分，其主要由骨髓产生。红细胞生成包括红系祖细胞、红系前体细胞和成熟红细胞阶段。红细胞生成过程中，由骨髓最早产生的红系祖细胞为增殖缓慢的红系爆式集落形成单位(burst-forming unit-erythroid，BFU-E)，之后BFU-E细胞分裂，并进一步分化为由红系前体细胞组成，并且细胞分裂迅速的红系集落形成单位(colony-forming unit-erythroid，CFU-E)。红系前体细胞先后经历原始红细胞、早幼红细胞、中幼红细胞、晚幼红细胞、网织红细胞5个阶段，最后脱核形成血液循环中的成熟红细胞，即红细胞终末分化阶段。
从红细胞谱系建立、红系祖细胞生成到红细胞终末分化，整个红细胞生成过程涉及复杂的调控网络，而单细胞测序等新技术的迅速发展，使研究者对红细胞生成调控网络的探索更为深入。近年，红细胞生成的调控机制被逐步阐明，特别是转录调控方面，GATA转录因子，Kruppel样转录因子(Kruppel-like transcription factor，KLF)，以及叉头转录因子对红细胞生成，均发挥重要转录调控作用。上述转录因子可作用于红细胞生成的各个阶段，通过靶向不同的红系特异性基因，在机体生理和病理状态下调控红细胞生成。笔者拟就这些转录因子在红细胞生成过程中，转录调控机制的研究进展进行综述如下。
GATA转录因子家族是红细胞生成过程中最重要的转录因子家族之一，其对红细胞生成的转录调控主要通过GATA1和GATA2发挥作用。GATA1和GATA2对红细胞生成的多个阶段均有影响，可调控红细胞谱系分化及血红蛋白(hemoglobin，Hb)的合成等方面。
GATA转录因子对红细胞生成调控最主要是通过调控红细胞谱系分化过程。生理状态下，GATA2高表达于造血干/祖细胞(hematopoietic stem/progenitor cell，HS/PC)，而GATA1则低表达。HS/PC向红系组细胞分化过程中，GATA1表达水平逐渐升高，同时GATA2表达水平下降，这种GATA1与GATA2表达水平的转换被称为"GATA转录因子开关"。HS/PC中GATA1的表达，受GATA1基因甲基化水平的抑制。特异性敲除小鼠GATA1基因的甲基化调控元件后，其HS/PC的GATA1表达水平升高，并且GATA2表达受抑制，GATA1促进HS/PC向红系组细胞分化，同时诱导HS/PC凋亡[1]。
对微小RNA(microRNA，miRNA)的研究进一步揭示GATA转录因子在红细胞谱系分化中的具体调控机制。miRNA-27a和miRNA-24可促进BFU-E和CFU-E的形成，从而增加成熟红细胞的数量，以及提高γ-珠蛋白mRNA的表达水平，从而促进红细胞生成。体外实验结果显示，在HS/PC中，GATA2占据miRNA-27a和miRNA-24启动子位点后，可抑制miRNA-27a和miRNA-24的表达和功能；而GATA1则可直接增强miRNA-27a和miRNA-24表达[2]。进一步研究发现，miRNA-27a可促进K562细胞系中γ-珠蛋白mRNA的表达，加快Hb的合成[3]。此外，miRNA-27a和miRNA-24还可反馈性抑制GATA2的翻译，促进"GATA转录因子开关"的转换，提高GATA1的表达水平，从而促进红细胞谱系分化[2]。Su等[4]在急性红白血病细胞系中发现，miRNA-23a可提高GATA1的表达水平和活性，恢复该细胞系中正常的红细胞生成。由此可见，"GATA转录因子开关"可以通过调控miRNA-27a和miRNA-24的表达，调控红细胞生成。
GATA转录因子家族中，GATA1参与调控Hb的合成。5-氨基乙酰丙酸合酶(5-aminolevulinate synthase，ALAS)2是血红素生物合成中的限速酶，可催化血红素前体物质5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinate，5-ALA)的生成[5]。GATA1可激活ALAS2的转录，促进血红素合成，同时GATA1亦可激活编码珠蛋白链的Hbb-B1和Hba-A1基因表达。应用基因编辑技术删除ALAS2上的GATA1结合域，可导致ALAS2的转录受阻，原始红细胞中血红素水平明显降低，同时影响Hbb-B1和Hba-A1基因的表达，α-和β-珠蛋白合成受限，阻碍正常的红细胞生成[6]。体外细胞培养实验中，向ALAS2转录受阻的原始红细胞中加入5-ALA，可使其血红素水平恢复至正常水平，并增加GATA1靶基因的表达，恢复Hb的生成[6]。近年，研究者在表达高水平血红素小鼠模型的晚期红系细胞(CD71＋ Ter119lo-hi)中发现，高水平的血红素可降低GATA1基因和有丝分裂梭形基因的表达，从而抑制红细胞有丝分裂，导致小鼠体内红细胞生成减少，此结果在体外细胞培养实验中，亦得到验证[7]。GATA1可启动血红素合成，GATA1和血红素共同介导红细胞成熟，而过高水平的血红素则抑制GATA1表达，这表明GATA1和血红素存在直接的反馈调节回路[7]。
Diamond-Blackfan贫血(Diamond-Blackfan anemia，DBA)属于先天性骨髓衰竭性疾病，主要表现为红细胞生成障碍。体外细胞培养实验结果显示，DBA患者的CD34＋细胞向红系细胞定向诱导分化过程中，红系祖细胞数量较健康个体减少、早幼红细胞体积变小，并且无晚幼红细胞和网织红细胞生成[8]。DBA患者可出现GATA1突变，导致GATA1蛋白N末端截短，产生GATA1s亚型[9]。应用诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)技术发现，GATA1s亚型iPSC中GATA1蛋白表达水平较正常GATA1 iPSC降低，红细胞生成潜力受损[10]。转录组学分析发现，GATA1s亚型iPSC存在某些关键谱系决定基因改变，如KLF1、GATA2、RUNX1和CEBPA基因，同时参与Hb合成的基因，如ALAS2基因等亦表达减少，从而导致红系分化及终末红细胞成熟障碍[10]。通过构建GATA1s亚型小鼠模型，进一步明确其存在GATA2和RUNX1表达水平的异常上调，导致红系祖细胞数量减少及红细胞终末成熟受损[9]。尽管GATA1s的DNA结合结构域完整，但是染色质免疫沉淀研究结果表明，其红系基因调节区的特异性结合域不完整，而非红系基因(包括巨核系和髓系基因)调节区的结合域正常，这导致GATA1s与红系特异性靶基因的结合效率降低，红细胞生成受阻，但是髓系和巨核系细胞生成增强[10]。
KLF家族亦为红细胞生成的关键调控因子，主要由红细胞特异性转录因子KLF1发挥作用，可调控红系谱系分化、Hb合成，以及红细胞的终末分化、成熟。KLF家族中的其他成员，如KLF2、KLF3等，也可直接或间接地参与调控红细胞生成。
KLF1可在红系-巨核系祖细胞及红系各阶段细胞中表达，通过与其他谱系特异性转录因子之间的相互作用，调控红系谱系分化。对人和小鼠造血祖细胞谱系分化的研究发现，KLF1与GATA1的转录水平呈正相关关系，二者在红系谱系的建立中发挥协同驱动作用[11]。在UT-7/GM细胞系中加入促红细胞生成素后，KLF1表达水平升高，并呈现阈值效应，即KLF1水平高于阈值，则激活调节反馈，将KLF1的表达水平控制在有效区间内，导致UT-7/GM细胞系不可逆地向红系分化[11]。这种调控受转录因子RUNX1的影响，后者通过增加与KLF1基因的结合，抑制KLF1基因表达，阻碍KLF1驱动的红系分化[12]。除此之外，此调控作用不受其他谱系相关的细胞因子，如促血小板生成素的影响[11]。
随着红系谱系的确立，KLF1主要定位于红系祖细胞的细胞质中，而在红系前体细胞阶段，KLF1向细胞核中转移，并与β-球蛋白基因位点共定位。通过对胎肝组织和红白血病小鼠模型的研究发现，KLF1是在CFU-E或者原始红细胞向早幼红细胞的发育过程中，从细胞质转移到细胞核内[13]。此转移过程对有效激活成年人β-球蛋白基因转录是必需的，并且随着红系谱系分化的进行，β-球蛋白基因与KLF1的共定位促进了这种激活[13]。此外，KLF1通过对γ-珠蛋白基因的调控，影响γ-珠蛋白的生成，从而影响胎儿Hb合成[13]。研究者采用离体分化的CD34＋脐血干细胞进行胚胎期红系细胞发育的研究发现，部分KLF1可直接结合于γ-珠蛋白启动子，促进γ-珠蛋白基因表达，同时KLF1也可使γ-珠蛋白阻遏物表达水平增加，从而抑制γ-珠蛋白基因的过表达[14]。因而，在胚胎时期红系细胞发育过程中，KLF1对Hb合成，具有正向和负向的双向调控作用[14]。
在红细胞分化的终末阶段，KLF1通过调控细胞周期抑制剂p18和p27的表达影响红细胞成熟。体外细胞培养实验结果显示，敲除晚幼红细胞的KLF1后，其体积较正常晚幼红细胞减小，细胞核凝聚，并持续进行细胞核极化，而不发生脱核[15]。这是由于在KLF1敲除的晚幼红细胞中，细胞周期抑制剂p18和p27表达水平降低，使细胞无法退出细胞周期，而不发生脱核，影响红细胞成熟。
在红细胞生成调控过程中，KLF家族的其他转录因子与KLF1之间存在相互作用。KLF2对于胚胎期红细胞生成至关重要，在小鼠发育过程中，KLF2与KLF1协同调控包括β-球蛋白基因在内的多种红系基因的表达[16]。与KLF1或KLF2单基因敲除小鼠相比，KLF1及KLF2双基因敲除小鼠胚胎祖细胞中，红系祖细胞数量显著减少，使红系分化障碍，导致小鼠外周血中红细胞缺乏，同时因β-球蛋白基因表达的减少促使贫血加剧[16]。K2F1可促进KLF2对红系前体细胞增殖的调控[16]。KLF3则主要发挥转录抑制作用。转录组学分析发现，KLF3可在人体关键的红系基因的启动子和增强子上置换KLF1，导致超过50个重要基因的转录异常。KLF1通过红系特异性启动子直接激活KLF3基因，而KLF3激活后反馈性抑制KLF1驱动的红细胞增殖。通过构建KLF3-/-上鼠模型发现，其发生贫血后可快速恢复，并且表现出持续的红细胞生成，这可能与解除了KLF3对KLF1的抑制作用有关[17]。
KLF1突变导致先天性红细胞生成异常性贫血患者的单个氨基酸改变，与小鼠中Nan(neonatal anemia)突变导致的氨基酸改变相同[18,19,20,21]。由于Nan突变的纯合子小鼠易发生宫内死亡，通常构建Nan-KLF1杂合突变小鼠或Nan-KLF1突变转基因细胞系作为疾病模型研究对象[18,19,20,21]。Nan-KLF1杂合突变可使KLF1靶基因异常表达，在Nan-KLF1杂合突变的转基因细胞系中，由KLF1调控的细胞周期抑制相关基因表达水平升高，导致红细胞增殖能力受损[19]。Nan-KLF1杂合突变可破坏与KLF1无关的红系基因或管家基因的活性，对红细胞产生毒性，导致在Nan-KLF1杂合突变转基因细胞系构建初期，红细胞存活率明显降低[19]。此外，Nan-KLF1杂合突变小鼠因Nan-KLF1蛋白的识别特异性发生改变，使KLF1与DNA结合的特异性下降，导致多种非KLF1靶向基因被激活，以及某些细胞因子的表达异常升高[19,20]。其中，铁调素水平异常升高，可抑制机体对铁的利用，从而导致Nan-KLF1杂合突变小鼠出现小细胞低色素性贫血；β-干扰素水平异常升高，抑制BFU-E和CFU-E阶段的红细胞生成[20,22]。Nebor等[21]对Nan-KLF1杂合突变小鼠的红细胞转录组进行分析，发现涉及细胞周期、DNA修复及翻译过程的红细胞转录组缺陷，并且这种改变在晚期幼红细胞中更为显著。这提示，Nan-KLF1杂合突变对红细胞终末分化的影响导致红细胞成熟障碍。
叉头转录因子家族并非红细胞生成的决定性调控因素，但FOXO3(forkhead box O3)及FOXM1 (forkhead box M1)与红细胞生成相关，并且有可能成为β-地中海贫血治疗的靶点。FOXO3主要作用于红细胞生成的晚期阶段，与红细胞的终末分化及成熟有关；而FOXM1则作用于红细胞生成的早期阶段，影响红系祖细胞及红系前体细胞的产生。
转录组学分析显示，FOXO3-/-上小鼠骨髓红细胞的自噬及线粒体清除相关基因表达降低[23]。FOXO3突变型小鼠模型的红细胞脱核过程中，核小体组装及DNA包装相关基因转录受损，细胞极化过程受抑制，最终使小鼠的成熟红细胞比例降低[23]。此外，FOXO3-/-小鼠的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信号通路被过度激活，使处于细胞周期S期的早幼红细胞比例增加[24]。由此推测，FOXO3通过对红细胞细胞周期的影响，阻碍红细胞的成熟。体外细胞培养实验结果显示，FOXO3异位表达可以逆转上述过程，并促进FOXO3野生型小鼠红细胞的脱核及成熟，这表明增强FOXO3活性，可促进红细胞生成[23]。该结果也在动物疾病模型中得到验证，对β-地中海贫血小鼠模型，给予抗氧化剂白藜芦醇，可增加FOXO3的表达，诱导小鼠红系前体细胞成熟。因此，抗氧化剂有可能成为β-地中海贫血患者的新疗法[25]。
采用人脐血CD34＋细胞分化的红系细胞，其FOXM1高表达，靶向敲低FOXM1后，红系祖细胞和前体细胞的数量均升高，并且红系祖细胞的增殖能力增强[26]。因此，应用FOXM1抑制剂亦可促进红系细胞生成，使其可能成为β-地中海贫血患者的治疗靶点。
近期，相关研究者对Hb合成相关转录因子的认识进一步深入。B细胞淋巴瘤/白血病(B cell lymphoma/leukemia, BCL)11A在Hb合成中发挥重要作用，可以抑制γ-珠蛋白的生成。Li等[27]研究结果证实，下调BCL11A表达水平，可以重新激活β-地中海贫血患者γ-珠蛋白的合成，同时不影响红细胞成熟，从而减轻患者的贫血。
综上所述，红细胞的生成调控过程复杂且精密。新近研究在红细胞生成的转录调控机制方面取得了诸多进展，GATA转录因子、KLF及叉头转录因子等调控转录因子与红细胞疾病密切相关。笔者认为，利用已经逐渐明确的红细胞生成调控机制，进行更深入的基础和临床研究，对红细胞疾病的诊治有重要意义。
所有作者均声明不存在利益冲突
