骨髓增生异常综合征(MDS)是一组异质性的克隆性髓样干细胞疾病，以全血细胞减少、向急性髓细胞白血病(AML)转化风险高为特点。目前，去甲基化药物(HMA)已广泛用于MDS治疗，在临床试验和实际应用中均展现良好疗效，但是HMA耐药现象普遍存在，并且MDS患者发生HMA耐药预后较差。笔者通过对HMA作用机制，以及影响HMA的药物代谢因素、免疫检查点通路(ICP)表达上调、白血病干/祖细胞(LSPC)无法被完全消除等HMA耐药机制的最新研究进展进行阐述，旨在探究MDS患者发生HMA耐药的可能机制及其解决方法。
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骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome，MDS)包括一组异质性的克隆性髓样干细胞疾病，以全血细胞减少，向急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)转化风险高为主要特点[1]。MDS发病机制复杂，包括染色体异常、癌基因与抑癌基因异常、骨髓造血干/祖细胞生长分化异常、单克隆性造血、免疫学异常、表观遗传学异常及分子生物学异常等[2,3]。DNA甲基化异常是MDS常见的表观遗传学改变，DNA甲基化水平和转录状态相关，参与细胞周期调控和凋亡的基因超甲基化可发生在MDS早期，并且与MDS进展有关。从表观遗传学水平研究抑癌基因甲基化可能对MDS的早期诊断、治疗方案优化及预后评估有重要的临床指导意义。
去甲基化药物(hypomethylating agents，HMA)作为特异性DNA甲基化转移酶(DNA methy transferase，DNMT)抑制剂，可抑制DNA异常甲基化，在治疗MDS的临床试验和实际应用中，均展现出良好的疗效。典型HMA包括阿扎胞苷(5-azacytidine，AZA)和地西他滨(5-AZA-2′-deoxycytidine，DAC)。然而HMA治疗MDS患者的有效率仅为30%～40%，有效时间为6～ 24个月[4,5]，MDS患者易发生HMA耐药，并导致MDS复发。MDS患者发生HMA耐药后，其预后通常较差[6]，并且目前HMA耐药机制尚未阐明。相对低危组MDS患者发生HMA耐药后的中位生存期为16个月[7]，而高危组MDS患者仅为4～6个月[8]。因此，笔者通过对HMA的作用机制及耐药机制进行阐述，以探究MDS患者发生HMA耐药的可能机制及解决方法。
HMA通过不可逆地抑制DNMT活性，逆转DNA甲基化过程，激活抑癌基因的表达[9]，诱导肿瘤细胞凋亡[9]，或者诱导肿瘤细胞向正常细胞分化[10]。同时，多项研究结果表明，DNA异常甲基化能降低肿瘤细胞的免疫原性，以及削弱免疫系统的抗肿瘤作用[11,12]。而HMA可能通过激活在表观遗传上沉默的内源性逆转录病毒元件，诱导α、γ干扰素的表达和分泌，上调参与有效抗肿瘤免疫的基因表达，增强肿瘤细胞的免疫原性和免疫系统的抗肿瘤免疫效应，发挥抗肿瘤作用[9,13,14]。在MDS患者中，相比单纯支持治疗或低剂量阿糖胞苷治疗等传统化疗方法，HMA可显著延长患者的无进展生存期，延长MDS转化为AML的时间，显著提高患者总体生存(overall survival ，OS)率和降低病死率，并且有效缓解患者输血依赖[15,16,17]。此外，AZA还能通过抑制调节性T细胞(regulatory T cells，Treg)增殖，直接或间接通过改良Treg诱导产生大量表达叉头框蛋白P3(forkhead box P3，FOXP3)和分泌白细胞介素(interleukin，IL)-17的效应T细胞，从而发挥对MDS患者的免疫调节作用[13]，而DAC并未发现有类似作用。
MDS具有异质性，其耐药机制亦具有多样性，这可能是造成MDS患者对HMA耐药率高，以及HMA单药治疗疗效不佳的原因。MDS患者对HMA的耐药机制尚未完全阐明，可能包括影响HMA药物代谢的因素，免疫检查点通路(immune checkpoint pathway，ICP)表达上调，白血病干/祖细胞(leukemia stem/progenitor cells ，LSPC)无法被完全清除等。此外，MDS患者机体对HMA的反应较为复杂，骨髓微环境也可能在调节药物反应上发挥作用[18]。
HMA进入细胞内需要在人平衡型核苷转运体(human equilibrative nucleoside transporter，hENT)1，2协助下完成，进入细胞内的HMA在脱氧胞苷激酶(deoxycytidine kinase，DCK)/尿苷-胞苷激酶(uridine-cytidine kinases，UCK)的作用下，形成活性代谢产物5-AZA-dCTP/5-氮杂-2-脱氧胞苷，掺入DNA或RNA中，发挥去甲基化作用。最终在胞苷脱氨酶(cytidine deaminase，CDA)催化作用下，成为无活性的尿嘧啶或脱氧尿嘧啶被排出体外。因此，hENT1表达水平过低、DCK缺乏、CDA活性增强等代谢异常，均可能在HMA耐药中发挥作用。
DCK和hENT1表达水平的降低，可能是引起MDS患者发生HMA原发性耐药原因之一。Qin等[19]对人白血病和淋巴瘤细胞系、前列腺癌细胞系、乳腺癌细胞系等多个肿瘤细胞系进行的体外研究结果显示，DAC的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration，IC50)与DCK mRNA及hENT1 mRNA的表达水平均呈负相关关系(r＝-0.63、P＝0.038，r＝-0.54，P＝0.068)；在对DAC耐药的细胞株MOLT4中，DCK mRNA及hENT1 mRNA的表达水平均较低，在对DAC耐药的细胞株PC3及DU145中，CDA mRNA表达水平最高，而在对DAC敏感的TF-1、U937、HEL等9种细胞株中，则未发现上述变化；在上述肿瘤细胞系中，AZA的IC50与DCK、CDA、hENT1、hENT2 mRNA的表达水平无相关性。上述结果提示，AZA和DAC的耐药机制并不相同。
DCK是将进入细胞内的AZA/DAC代谢为活性代谢产物的关键酶。若基因启动子区域富含CpG，DNA超甲基化可使其沉默。然而，Qin等[19]通过焦磷酸测序技术检测多个肿瘤细胞系DCK甲基化水平的结果显示，即使在DCK基因表达水平最低的细胞系中，亦没有检测到任何异常的DNA超甲基化。DCK mRNA在耐药细胞系中表达降低，这可能是由组蛋白去乙酰化，或者针对DCK的微小RNA(micro RNA，MiRNA)等其他机制所致[19]。而Sripayap等[20]研究结果显示，在对AZA耐药的HL60和THP-1细胞，以及对AZA敏感的上述细胞系的亲代细胞中，UCK2表达水平相近，这可能是由于对AZA耐药的细胞中存在UCK2基因突变，降低了UCK2的活性，导致AZA的激活受到干扰，从而无法抑制DNMT。总体而言，DCK导致MDS患者对HMA耐药的机制，尚待进一步研究证实。目前，Unnikrishnan等[21]开发了一种新型多参数定量质谱技术(multiparameter, quantitative mass spectrometry)，能够准确定量样品中RNA、DNA，以及细胞质中AZA核糖核苷(5-AZA-cr)和脱氧核糖核苷(5-AZA-CdR)的丰度，同时可检测DNA、RNA的甲基化水平。对这种技术进一步优化，可能对AZA或5-AZA-CdR的细胞内代谢进行全面的动力学分析，从而能促进MDS患者发生HMA耐药机制的进一步研究。
免疫检查点程序性死亡因子(programmed death，PD)-1/PD-1配体(PD ligand，PD-L)1和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen，CTLA)-4能通过提高免疫细胞激活阈值、抑制细胞增殖、促进细胞凋亡，从而终止或减轻免疫反应强度[22]，其在实体瘤和髓系肿瘤中，均发挥调节T细胞活化和抗肿瘤免疫监视的作用[23]。研究结果显示，HMA对ICP表达上调具有诱导作用[18,24]。Yang等[18]对124例接受DAC治疗(58%患者为初治)的MDS、AML和慢性粒单核细胞白血病(chronic myelomonocytic leukemia，CMML)患者PD-1、PD-L1、PD-L2和CTLA-4表达水平的研究结果显示，在69例MDS患者的CD34＋细胞中，PD-L1、PD-L2、PD-1和CTLA4表达水平异常上调(≥正常参考值的2倍)的患者比例分别为36%(25/69)、12%(8/69)、8%(5/69)和6%(4/69)，在外周血单个核细胞中，PD-L1、PD-L2、PD-1和CTLA4表达水平异常上调(≥正常参考值的2倍)的患者比例分别为50%(35/69)、6%(4/69)、61%(42/6)和8%(5/69)，并且在经不同浓度的DAC处理的KG-1、THP1细胞系中，上述免疫检查点的表达水平呈剂量依赖性持续增高。另外Yang等[18]进行的临床试验(NCT00948064)发现，接受AZA治疗的MDS/AML患者中，对AZA耐药者的PD-L1、PD-L2、PD-1和CTLA4表达水平较对AZA敏感者有增高趋势(P＝0.122)，并且治疗后PD-L1和PD-L2表达水平增高患者较未增高者的中位生存期显著延长(P＝0.029)。Ørskov等[24]对27例采用AZA治疗的MDS/AML患者的研究结果显示，12例(44%)患者外周血T细胞中PD-1启动子发生去甲基化；与健康对照组(n＝5)相比，对AZA无应答组(n＝17)患者T细胞中PD-1启动子的甲基化水平显著升高，这证明在MDS/AML患者体内AZA对PD-1的表达水平有直接影响。这提示，在AZA治疗MDS/AML患者过程中，PD-1的激活可能是其对AZA耐药的机制。HMA使MDS/AML患者的骨髓瘤细胞、免疫细胞上ICP表达上调的原因，可能是HMA诱导骨髓瘤细胞产生的促炎性因子和干扰素的分泌效应[25,26]，以及HMA的去甲基化作用[12,18]。Yang等[18]进而提出，ICP表达上调可能造成肿瘤特异性T细胞功能下降，甚至肿瘤特异性T细胞被耗尽，进而导致肿瘤免疫逃逸，促进肿瘤发展，造成耐药性和治疗反应丧失。
免疫检查点抑制剂的单独或者联合使用，已经在黑色素瘤、肾细胞癌、霍奇金淋巴瘤等多种肿瘤治疗中，显示出良好的临床疗效[27,28,29]。这些重要研究结果提示，HMA可以与针对CTLA-4、PD-1或PD-L1的免疫检查点抑制剂联合应用，相互增强对MDS细胞的免疫反应，改善MDS患者预后。研究结果显示，HMA和免疫检查点抑制剂的联合应用，已在MDS患者的治疗反应率和OS率方面显示出初步优势[30]。目前，亦有多项相关临床试验正在进行中，如采用PD-L1抗体durvalumab与AZA联合治疗中、高危MDS及不适合接受诱导化疗的AML患者的临床试验(NCT02775903)，采用PD-1抗体nivolumab和CTLA-4抗体ipilimumab与AZA联合治疗MDS患者的临床试验(NCT02397720)等。目前，HMA和免疫检查点抑制剂联合治疗MDS，仍是一种新型治疗方法，其有效性和安全性仍需多中心、大样本量的随机对照临床试验结果证实，并且应进一步优化科研设计，研发新药，探索最优生物标志物，降低药物不良反应，以延长MDS患者OS期。
Craddock等[31]对使用AZA和组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸钠(sodium valproate，Val)治疗的64例AML患者和15例MDS患者的多能祖细胞样LSPC和粒-单核细胞祖细胞样LSPC数量进行检测，结果显示，即便在获得完全缓解患者(n＝4)中，含有LSPC的细胞群数量显著减少，但未被完全消除；而在对治疗无应答患者中，含有LSPC的细胞群数量并无显著减少，这些细胞进一步增殖即可导致MDS复发，并且其增殖发生于MDS形态学复发前[31]。该结果提示，AZA联合Val治疗不能完全消除MDS患者体内的LSPC。Will等[32]和Unnikrishnan等[33]亦获得类似研究结果。
因此，耐药LSPC可能形成一个细胞库推动MDS的临床复发，而研发针对耐药LSPC的药物，可能有效延迟MDS的复发。此外，对含有LSPC细胞群的定量测定，可能作为一个关键的生物学治疗终点，被纳入接受表观遗传学治疗MDS患者的疾病反应和复发研究中，而对LSPC分子特性的研究，将有助于预测MDS患者的临床结局[34]。现在，仍需要在获得完全缓解的患者中进行LSPC定量的研究，以证实监测其作为疾病复发预测标志物的有效性。同时也意味着治疗必须依赖LSPC的根除，要探索促进MDS发病的LSPC中的关键分子事件，开发针对该细胞群的药物作为克服HMA耐药结局的治疗策略。Brett等[35]证明，CD123是LSPC的标志物之一，并认为MDS干细胞室中CD123表达水平的上调，是代表MDS向AML转化时晚期致病进程的独特标志物。另外，与蛋白质合成相关信号通路的激活，可能是CD123＋LSPC最常见的转录特性，其针对蛋白质合成及能量代谢有可能成为选择性靶向LSPC的一种手段。目前，以CD123为靶点治疗MDS的多项临床试验正在进行中，如针对CD123的单克隆抗体(NCT02472145、NCT02992860)，针对CD123和CD3的双特异性抗体(NCT02715011、NCT02730312、NCT02152956)，嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T)(NCT03114670、NCT02159495)等。然而，靶向CD123的MDS治疗方法还未成熟，减轻对患者造血组织潜在毒性的治疗策略仍有待进一步研究。
HMA耐药后治疗是MDS临床治疗的巨大挑战之一，而充分认识HMA耐药机制有助于探索新的治疗措施。MDS在耐药机制方面存在异质性。识别MDS细胞特性，可以迈向精准靶向治疗，在选择最佳治疗方案方面，将具有重要临床价值。未来MDS靶向治疗的发展，可能需要更深入地探索调控致病LSPC的分子途径，研发针对LSPC的药物，消除克隆性造血，从而防止复发。HMA可以启动MDS对其他抗肿瘤治疗的反应[36]，以HMA为基础的联合治疗在提高MDS疗效上已初露端倪，成为当前的研究热点之一。多项关于HMA与免疫检查点抑制剂(NCT02397720、NCT02775903、NCT02508870)、异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase，IDH)1或IDH2抑制剂ivosidenib，enasidenib(NCT02719574 ，NCT03383575)，调节突变TP53转录活性的APR-246(NCT03072043)等联合应用于治疗MDS的临床试验目前正在进行中。而随着新药的不断研发和治疗组合的不断完善，HMA联合治疗在改善MDS患者整体疗效方面将有更广阔的临床应用前景。目前，有关HMA联合用药的临床试验大部分仍在进行中，并且临床样本量相对较小，因此其研究结果仍存在不确定性，缺乏最佳治疗方案，而潜在有效的治疗分子生物标志物及有效人群的确定，有待于大量临床前及临床试验研究结果进一步证实。
所有作者均声明不存在利益冲突
