多发性骨髓瘤(MM)为一种浆细胞恶性肿瘤，其发病率较高。MM患者的免疫细胞数量及功能存在明显异常，其中CD4+T细胞在MM的发生、发展中发挥着重要作用。在MM患者骨髓微环境中，可观察到辅助性T(Th)1/Th2平衡紊乱、调节性T细胞(Treg)增多所致的MM细胞免疫逃逸，以及Th17、Th22等通过分泌细胞因子介导的促肿瘤效应，促进MM的发生、发展。为了加深对MM患者骨髓微环境中CD4+ T细胞亚群作用的理解，从而为MM的免疫治疗提供新思路，笔者在分析MM患者Th1、Th2、Th17、Treg及Th22细胞亚群生物学特征的基础上，重点阐述上述各CD4+ T细胞亚群参与MM发生、发展的研究现状。
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多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一种浆细胞恶性增殖性疾病，目前仍不可治愈。骨髓微环境在MM发生、发展中发挥重要作用。骨髓微环境中的细胞种类主要包括骨髓基质细胞、破骨细胞、内皮细胞及各类免疫细胞。MM细胞和骨髓微环境相互作用，影响MM进展[1]。骨髓微环境中免疫细胞改变，既可能是导致MM进展的原因之一，也可能是继发于MM患者生理功能紊乱的结果。MM患者的体液免疫和细胞免疫功能通常存在异常，充分认识骨髓微环境中免疫细胞对MM的影响，对于阐明MM的发病机制、发现新的预后标志物，以及提供新的免疫治疗靶点等具有重要意义。CD4+T细胞是免疫系统的关键组成部分。根据所分泌的细胞因子和功能特性的不同，CD4+T细胞可分为多种细胞亚群，包括辅助性T细胞(helper T cell，Th)1，Th2，Th9，Th17，Th22，调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)，以及滤泡Th(follicular Th，Tfh)等[2]。由于目前尚无关于Th9及Tfh与MM发生、发展相关的文献报道，笔者拟就Th1、Th2、Th17、Th22及Treg的生物学特征及其在MM发病中作用的研究现状介绍如下，旨在加深对骨髓微环境中CD4+T细胞亚群介导MM发病机制的了解，并为免疫治疗的开展提供理论基础。
Th1是以分泌γ干扰素，白细胞介素(interleukin，IL)-2，肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α等细胞因子为特征的一类CD4+ T细胞。γ干扰素可通过激活巨噬细胞及诱导产生免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)G类抗体，发挥抗体介导的免疫调节作用，从而增强吞噬细胞功能，在清除细胞内病原体中发挥作用。此外，Th1也参与迟发型超敏反应。Th2主要分泌IL-4、-5、-9、-13等细胞因子，可刺激B细胞产生高水平IgM类抗体，并可使IgM类抗体发生Ig类别转换，如IgM转换为IgG、IgE等，同时可诱导嗜酸性粒细胞和肥大细胞分化，在防御细胞外寄生虫感染和变态反应中发挥重要作用。Th1和Th2特异性转录因子分别是T-bet和GATA3。Th1和Th2在机体的正常生理状态下，始终保持动态平衡，从而维持机体正常的免疫功能[2]。
多项研究结果显示，MM患者体内存在明显的Th1/Th2平衡异常，并且在疾病的不同阶段Th1/Th2也会发生变化[4,5,6]。Th1/Th2与MM患者的疾病分期、进展及预后等相关，然而不同研究关于MM患者Th1/Th2改变的报道结果不一致，甚至相互矛盾。部分研究发现，MM患者Th1/Th2升高，Th1/Th2平衡异常[4,6]。Feng等[4]研究结果显示，MM患者(n＝33)外周血中Th1数量、血清γ干扰素水平及特异性转录因子T-bet表达水平，均较健康个体(n＝28)显著升高(P<0.05)，但是MM患者和健康个体的Th2数量比较，差异却无统计学意义(P>0.05)。Ogawara等[6]发现，与健康个体(n＝17)比较，初诊(n＝27)及复发/难治性(n＝15)MM患者外周血Th2数量均显著减少，并且差异有统计学意义(P<0.05)；而Th1数量，Th1/Th2比较，差异无统计学意义(P>0.05)；但是与健康个体比较，伴高Th1/Th2患者血清β2微球蛋白水平显著升高，并且差异有统计学意义(P<0.05)。
然而，Sharma等[5]研究结果尽管也证实了MM患者体内存在Th1/Th2平衡异常，但是部分研究结果与上述研究相矛盾。该研究发现，与健康个体(n＝50)相比，初诊MM患者(n＝62)外周血中Th1分泌的γ干扰素水平显著降低(P<0.001)，而Th2分泌的IL-4、-10水平均显著升高(P<0.001)。MM患者Th1/Th2平衡异常，Th2相较于Th1在功能上更占据优势。上述研究结果表明，MM患者骨髓微环境中Th1/Th2平衡异常的原因尚不明确。而Th1和Th2数量及功能异常，均可导致Th1/Th2平衡异常。这提示，MM患者的免疫状况可能存在较高的异质性。
目前，Th1的抗肿瘤效应得到相关研究者的一致认同[7]。Haabeth等[8]将MM细胞包被在基质胶中，并将其经皮下注射接种至小鼠体内以模拟MM微环境，从而研究抗MM免疫应答的过程。该研究发现，Th1及其分泌的γ干扰素可通过以下多个方面促进巨噬细胞的抗MM作用。①在γ干扰素参与的诱导活化作用下，单核细胞分化为经典活化型巨噬细胞(M1型)，M1型巨噬细胞通过释放一氧化氮(NO)，活性氧族(reactive oxygen species，ROS)等，直接杀伤肿瘤细胞或者参与Th1免疫应答；② γ干扰素诱导巨噬细胞分泌CXC基序趋化因子配体(CXC motif chemokine ligand，CXCL)9和CXCL10抑制血管新生，从而抑制肿瘤细胞生长；③在Th1/Th2平衡向Th1极化的环境中，巨噬细胞分泌的IL-1α、-1β、-6等促炎细胞因子，可能通过募集外周血循环中的白细胞，并刺激CD4+ T细胞的功能参与清除肿瘤细胞。上述研究结果表明，Th1在MM免疫应答中发挥关键作用，是参与机体免疫监视的重要组成部分。这提示，当Th1免疫功能发生缺陷时，机体免疫监视和免疫应答受损，MM细胞容易发生免疫逃逸，促进MM进展。
另一方面，在肿瘤微环境中，Th2分泌的IL-4、-10、-13及嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞等，诱导单核细胞向活化型巨噬细胞(M2型)分化。M2型巨噬细胞能够参与促进肿瘤生长和转移、抑制特异性免疫和肿瘤微血管形成[9]，因此Th2免疫应答对MM的进展具有促进作用。然而，目前关于Th2在MM免疫应答中发挥负向作用的认识并不全面，并非在所有肿瘤中Th2浸润都意味着患者预后不良[7]。Lorvik等[10]利用过继免疫疗法予MM小鼠模型输注Th2发现，Th2可识别巨噬细胞提呈的MM肿瘤特异性抗原，并分泌相关细胞因子诱导巨噬细胞产生精氨酸酶，精氨酸酶进一步降解精氨酸以抑制肿瘤细胞相关蛋白的合成；同时，Th2能够分泌具有抗肿瘤作用的细胞因子，如IL-4、-15等，输注Th2后小鼠体内MM细胞被清除。上述研究结果证实，Th2过继免疫疗法在MM动物模型中的有效性，Th2与肿瘤浸润性巨噬细胞能够协同发挥抗MM作用，为MM及其他肿瘤的免疫治疗提供了新策略。
Th17是一类主要分泌IL-17A、-17F、-21和-22等细胞因子的CD4+ T细胞亚群，在针对部分细菌和真菌感染的免疫应答中，发挥至关重要的作用，并与炎症反应和自身免疫性疾病的发生密切相关。此外，Th17在肠道中含量丰富，参与调节肠道菌群，是肠道黏膜免疫屏障的重要组成部分。维甲酸相关孤儿受体(retinoic acid receptor-related orphan receptor，ROR)γt是调控Th17分化的主要转录因子[2]。
Treg是一类免疫抑制性细胞，其主要功能是维持机体的免疫稳态和免疫耐受。根据细胞发育分化部位的不同，Treg可分为胸腺来源Treg(thymus-derived Treg，tTreg)，外周来源Treg(peripherally derived Treg，pTreg)及体外诱导的Treg(in vitro-induced Treg，iTreg)。叉头框蛋白(forkhead box，Fox)p3是调控Treg分化和功能的主要转录因子，然而Treg的分化和功能的发挥，并不仅依赖于Foxp3的表达，稳定的表观遗传修饰也在其中发挥重要作用[11,12]。
与Th1/Th2类似，Th17/Treg在正常机体中也维持动态平衡，二者在分化和功能上相互调节及拮抗，共同维持机体正常的免疫效应[11,12]。在肿瘤患者体内，Th17引起的过度炎症反应和Treg引起的过度免疫抑制，可能是导致肿瘤发生、发展的原因之一[13]。因此，探索Th17/Treg平衡在MM患者骨髓微环境中的作用对于深入理解MM的发病机制及探索新的治疗靶点具有重要意义。
目前，有关MM患者体内Treg的数量和功能仍存在争议。尽管有研究报道，MM患者与健康个体骨髓中Treg数量比较，差异无统计学意义(P>0.05)，其功能亦无明显改变，并且Treg数量与MM肿瘤负荷和疾病状态无明显相关性(P>0.05)[13,14,15]。然而，更多的研究结果支持Treg在MM疾病进展中促进MM细胞免疫逃逸，Treg数量增多与MM患者的高肿瘤负荷和不良预后均呈正相关关系(P<0.05)。Alrasheed等[16]发现，与骨髓中Treg比例较低MM患者(≤3.31%，n＝38)比较，Treg比例较高者(>3.31%，n＝37)的无进展生存(progression-free survival，PFS)期更短(HR＝2.91，95%CI：1.21～7.04，P＝0.021)。因此，关于MM患者骨髓微环境中Treg异常及其对疾病发生、发展的作用，仍有待进行更多深入的研究，并探讨Treg作为MM免疫治疗靶点的可行性。
根据现有文献报道，参与导致MM患者体内Treg增多的机制可能包括以下多个方面。①细胞间直接接触作用。肿瘤细胞和肿瘤旁邻细胞通过细胞间接触传递刺激信号至初始CD4+ T细胞，诱导其分化成为Treg[17]。②非直接接触作用。MM细胞分泌的Ⅰ型干扰素，破骨细胞分泌的增殖诱导配体(a proliferation-inducing ligand，APRIL)等，均能够以不同方式作用于Treg，促进Treg增殖或者增强Treg功能[18,19]。③胞啃作用(trogocytosis)。胞啃作用是细胞间膜蛋白或其他膜成分传递的方式之一，淋巴细胞通过这种方式可发生表型或者功能改变，也可实现细胞间的信息交流。Brown等[20]发现，在骨髓微环境中，效应T细胞可通过胞啃作用，从MM细胞膜表面获得CD86和人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)-G抗原，并发生功能改变，从而获得与野生型Treg相似的免疫抑制功能。因此，上述研究结果表明，在MM进展过程中，Treg和MM细胞通过多种细胞间通讯途径发挥互相促进的作用，这是MM细胞发生免疫逃逸的重要机制之一。
由于Treg参与MM的发生、发展，针对Treg的靶向治疗是否能够改善机体的免疫功能，增强抗肿瘤免疫反应，提高MM疗效是目前相关研究的热点之一。MM患者体内Treg中存在CD38高表达亚群。体外实验结果显示，CD38+Treg比CD38-Treg具有更强的免疫抑制活性(P<0.05)[21]，并且MM患者体内CD38+ Treg比例明显高于健康个体(P<0.05)[22]。CD38单克隆抗体可以通过特异性抑制CD38+Treg活性发挥强效的免疫调节作用，恢复机体抗MM细胞的免疫效应。CD38+ Treg高比例的复发/难治性MM患者接受CD38单克隆抗体治疗可以获益[22,23]。因此，上述研究结果提示，减少MM微环境中Treg数量，抑制Treg功能可能是治疗MM的有效策略之一。
Th17在肿瘤中的作用目前尚存在争议。在肿瘤发生过程中，Th17是发挥促进还是抑制作用与肿瘤类型有关[13]。研究结果表明，MM患者外周血中Th17比例高于健康个体[外周血：(4.49±0.78)%比(2.05±0.30)%，P<0.05]，而骨髓中的Th17比例相比，差异却无统计学意义[(2.85±0.78)%比(1.67±0.29)%，P>0.05][24]。此外，MM患者外周血中Th17数量与疾病进展相关，Ⅲ期MM患者外周血中Th17比例较Ⅰ、Ⅱ期患者显著升高[(2.69±0.94)%比(1.55±0.47)%，P＝0.015][25]。经治疗获得完全缓解(complete remission，CR)的MM患者外周血中Th17比例较初诊时显著降低[(1.34±0.73)%比(2.32±0.45)%，P＝0.013][26]。Ma等[26]研究发现，初诊时Th17数量正常的MM患者(n＝16)PFS期[22个月(95%CI：14.43～29.57个月)]长于初诊时Th17数量高于[15个月(95%CI：9.87～ 20.13个月)，P＝0.068]或者低于[14个月(95%CI：6.25～21.75个月)，P＝0.057]正常参考值范围的患者。上述研究结果提示，MM微环境中确实存在Th17异常，并且MM患者外周血或者骨髓中Th17数量可能可以作为评估患者预后的潜在指标之一，但是仍需更多研究证实。
Dhodapkar等[27]发现，成熟的树突状细胞作为抗原提呈功能最强的细胞，能够有效诱导MM患者骨髓中Th17的产生和增殖。此外，体内的肠道菌群能够调节免疫细胞而影响疾病发生、发展。在MM小鼠模型中，肠道菌群中的解肝素普雷沃氏菌能够促进肠道中Th17的分化，并向骨髓迁移[28]。Li等[29]研究亦发现，微小RNA(microRNA, miRNA)也可以参与调节Th17亚群的分化和功能，促进MM进展。
目前关于Th17在MM发生、发展中的作用及机制研究，主要围绕其特征性的细胞因子IL-17展开，主要包括下述多个方面。①Th17参与介导MM溶骨性骨病的发生[30]，IL-17可以促进破骨细胞的分化与成熟，促进骨质破坏导致MM骨病的发生、发展。② Th17参与MM新生微血管的形成，尽管其具体机制尚未进一步阐明，但是已有研究发现，在纤维肉瘤和结肠癌小鼠模型中，IL-17通过促进血管内皮细胞迁移，同时刺激成纤维细胞分泌血管生成因子，如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，前列腺素和NO等，造成MM微环境中血管新生相关激活因子和抑制因子失衡，促进肿瘤微血管形成[31]。③ IL-17可直接促进MM细胞增殖、存活，IL-17与MM细胞表面IL-17受体结合，进而促进MM细胞增殖[24]。此外，IL-17也可通过激活MM细胞内与细胞增殖、存活相关的信号通路，促进MM细胞生长[32]。④ Th17抑制机体免疫功能，Th17分泌的促炎因子IL-1、-13、-17、-22、-23均可以抑制T细胞免疫反应，可能导致MM进展及自身免疫性疾病的发生[24]。因此，Th17主要发挥促进MM发生的作用，其分泌的IL-17可以通过多种途径介导MM进展。
文献报道，靶向IL-17A单克隆抗体AIN457在体外能够显著抑制MM细胞增殖(P<0.05)；与仅采用同型对照抗体处理的MM小鼠模型比较，采用AIN457处理的MM小鼠模型体内肿瘤体积显著缩小(d24减小37%，d30减小47%，P<0.05)；此外，在MM小鼠模型中应用AIN457能够减少骨吸收，改善MM骨病[33]。因此，靶向Th17的治疗可能帮助缓解MM进展，改善患者预后。
由于Treg和Th17在分化和功能上相互拮抗，Treg/Th17可能更能代表机体的免疫状况，对MM疾病预后的预测价值更高。因此，有研究者认为测定Treg/Th17比单纯测定Treg或者Th17数量对于MM患者预后预测更具有临床意义和价值[34]。上述研究结果提示，在MM患者骨髓微环境中，Treg和Th17均能够对MM的进展发挥促进作用。因此，Treg/Th17对MM的临床预测价值仍有待更多研究验证。
Th22主要分泌IL-22、-13和TNF-α等细胞因子，Th22主要依赖其分泌的特异性细胞因子IL-22，参与包括炎症反应、自身免疫性疾病和肿瘤等疾病的发生、发展。芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor，AHR)是调控Th22分化的特异性转录因子，激活AHR可促进IL-22产生，同时减少IL-17产生[35]。因此，Th22也是MM微环境中不可忽视的一类Th，有待进一步研究以获得对MM微环境更加全面的了解。
关于Th22及其分泌的相关细胞因子与MM的关系，目前文献报道较少。Di Lullo等[36]研究发现，Th22分泌的IL-22、-13均能够以直接或者间接的方式促进MM进展。一部分MM细胞高表达IL-22受体(IL-22 receptor，IL-22R)A1，IL-22与之结合后使信号传导及转录激活蛋白(signal transducer and activator of transcription，STAT)3发生磷酸化，诱导MM细胞生长和耐药；IL-13则可通过增强骨髓中间充质干细胞分泌IL-6和表达黏附分子，促进MM细胞生长。上述研究结果提示，Th22参与MM的发生、发展，有望成为MM靶向治疗选择之一。
短链非编码RNA中的miRNA可对基因进行转录后调控，参与细胞增殖、发育和分化等多个生物学过程，并且在多种肿瘤发生中发挥重要作用，其中部分miRNA被认为是癌基因或者抑癌基因。与正常浆细胞相比，MM细胞中存在多种miRNA水平异常，这些miRNA与MM的进展密切相关。MM患者通常伴13q14染色体缺失，miRNA-15/16位于该染色体区域，导致伴13q14染色体缺失MM患者的骨髓微环境中miRNA-15a表达水平降低，而miRNA-15a/16表达水平与MM细胞对化疗药物的敏感性相关。此外，近期研究还发现，miRNA-15/16能够抑制B细胞的增殖，并阻滞T细胞周期，抑制T细胞存活及记忆T细胞的分化过程[37]。因此，miRNA可以通过调控CD4+T细胞发育、分化等过程来影响机体的免疫功能，导致MM发生、发展。
MM微环境中的多种CD4+T细胞亚群与MM的发生、发展，以及患者治疗反应和预后等密切相关。尽管目前MM仍是一种不可治愈的疾病，但是免疫治疗，包括免疫调节剂的应用，如来那度胺、泊马度胺等，很大程度上改善了MM患者的生存质量和预后。因此，充分认识MM患者的免疫状况，特别是Th1、Th2、Th17、Th22及Treg的作用，可为进一步提高免疫治疗的疗效和实现个体化治疗奠定基础。通过增强机体的免疫功能，减少肿瘤细胞免疫逃避，改善骨髓微环境等途径提高MM疗效，延长患者生存时间，具有重要的理论价值和实际意义。
所有作者均声明不存在利益冲突
