近年，肿瘤免疫治疗已成为肿瘤治疗的重要方法之一。免疫治疗主要包括肿瘤非特异性小分子化合物免疫治疗，过继细胞免疫治疗(adoptive cellular therapy，ACT)，肿瘤疫苗，肿瘤单克隆抗体，分子靶向治疗及基因治疗等^[1,2]。而嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T)免疫疗法作为过继免疫治疗中的一种新型靶向治疗，在急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)和B细胞白血病/淋巴瘤(B-cell leukemial lymphoma，BCL)等血液肿瘤的治疗中显示出良好疗效，被认为是当前最有前景的肿瘤治疗方式^{[2,3,4,5,6,7,8]}。嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)是由抗原结合区与共刺激分子组成的融合分子，具有特异性识别肿瘤细胞的能力，并且不依赖于人类白细胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)，也不受限于蛋白类肿瘤抗原^[9]。CAR-T的作用机制是通过基因转导使患者或异体来源T细胞能够表达可特异性识别肿瘤抗原的CAR，并将改造后的T细胞输注至患者体内，从而杀死肿瘤细胞。

目前，CAR-T免疫疗法在白血病、淋巴瘤等血液肿瘤治疗中显示出较好的抗肿瘤效应。多项研究结果显示，对于部分肿瘤细胞，可能由于抗原表达的异质性，或者靶抗原的丢失、表达水平下调，而导致CAR-T治疗无效^{[10,11,12,13,14]}。为克服肿瘤抗原丢失或者表达水平下调以增强CAR-T的抗肿瘤效应，构建双靶点CAR-T是目前相关研究的热点之一。

根据双靶点CAR-T结构和治疗模式的不同，分为串联型、复合型、序贯型和共转导型双靶点CAR-T。串联型双靶点CAR-T是将2种抗体的抗原结合域以不同的构型连接到跨膜和T细胞信号域，即将2个CAR以单个分子形式表达，这相较于单个抗原特异性CAR可以体现出更强的抗肿瘤活性^{[10,15,16,17]}。复合型双靶点CAR-T是单一载体编码2种不同的CAR分子，每个CAR分子可以分别识别不同的靶点，从而提供更加全面的肿瘤杀伤范围，克服单靶点治疗的缺陷^[10,18,19]。序贯型双靶点CAR-T是分别制备2种不同靶点的CAR-T，然后进行同时或者按一定顺序给药。共转导型双靶点CAR-T是采用2种独立载体对T细胞进行修饰，从而得到表达1或2种CAR的混合CAR-T^[20]。笔者拟就双靶点CAR-T免疫疗法在BCL，多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)，急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)等血液肿瘤中的研究最新进展进行阐述如下，旨在为CAR-T多重靶向技术的研发提供思路。

CAR-T免疫疗法在BCL中的研究已取得显著进展，疗效良好。常用的CAR-T靶点包括CD19、CD20及CD22等^{[21,22,23,24,25]}。然而，CAR-T的应用通常受到抗原丢失的限制，导致患者在接受CAR-T免疫疗法后出现复发^[26,27,28]。Fry等^[29]研发了一种能够同时识别CD19和CD22的双靶点CAR-T，通过将CD19和CD22单链可变片段(single chain fragment of variable region，scFv)序列结合到二价受体中以构建CAR。在体外细胞杀伤实验结果证实，其对CD19⁺ CD22⁺ B淋巴细胞白血病(B cell acute lymphoblastic leukemia，B-ALL)细胞系具有细胞毒性。同时在异种移植B-ALL细胞的免疫缺陷小鼠模型中发现，双靶点CAR-T显示出清除B-ALL细胞的能力。这提示，双靶点CAR-T治疗B-ALL可以克服抗原丢失所导致的对免疫治疗不敏感。

2015年，Schneider等^[30]制备了同时靶向CD19、CD20这2种肿瘤抗原的双靶点CAR-T，并且通过应用将CD19、CD20单链抗体的CAR结构进行串联构建以克服抗原逃逸。流式细胞术检测结果显示，CD19/CD20双靶点CAR-T比例高达50%~70%；并且在体外白血病细胞和CD19/CD20双靶点CAR-T及CD19-CAR-T、CD20-CAR-T的共培养实验结果显示，与CD19-CAR-T、CD20-CAR-T相比，CD19/CD20双靶点CAR-T中的细胞因子γ干扰素被有效诱导释放，对CD19⁺ CD20⁺靶细胞的杀伤作用显著。2016年，Zah等^[17]在双靶点串联方法的基础上，采用或门(or-gate)关系处理CD19和CD20 2个抗原信号，成功构建可阻止抗原逃逸的串联型CD19/CD20双靶点CAR-T。当靶细胞上存在CD19或者CD20靶点时，CD19/CD20双靶点CAR-T能够介导产生大量的细胞因子，并且发挥细胞毒性作用，从而对靶细胞进行杀伤。并且在体内实验中，CD19/CD20双靶点CAR-T对原发性CD19阴性和野生型B-ALL也能够发挥杀伤作用。

CD37作为四通道跨膜蛋白，参与淋巴细胞的多种生物学过程，包括存活、增殖、黏附及迁移等^[31]，同时其也在成熟淋巴细胞上高表达，而在T细胞、中性粒细胞、单核细胞上几乎不表达。Scarfò等^[32]针对表达CD37的B细胞淋巴瘤的CAR结构进行了优化，在第2代4-1BBζ-CD3载体的基础上，构建了2个CD19-CAR和CD37-CAR连接顺序不同的双靶点CAR-T。在体外细胞毒性实验中，双靶点CAR-T对表达CD19和CD37单个靶点或者2个靶点的细胞系均有杀伤反应，并且在针对Jeko-1肿瘤细胞系的体内实验中，CD19/CD37双靶点CAR-T和CD19-CAR-T、CD37-CAR-T均能在第14天完全清除Jeko-1肿瘤细胞。这表明，双靶点CAR-T细胞可以杀伤表达1种或者2种抗原的靶细胞，并且达到与单个抗原特异性CAR-T同样的杀伤效果。

白细胞介素(interleukin，IL)-3受体α链(CD123)在多种血液肿瘤中均有表达^[33,34,35]，并且在对化疗耐受或者初治后复发的AML干细胞上也有表达^[36,37]。Ruella等^[38]研究发现，部分接受CD19-CAR-T治疗后复发的B-ALL患者体内存在CD123表达。研究者随后采用携带CD19-CAR和CD123-CAR的质粒感染慢病毒并转化T细胞，构建CD19/CD123双靶点CAR-T，并且发现在小鼠体内实验中，CD19/CD123双靶点CAR-T在输注后第9天时表现出更强的抗B-ALL细胞活性，同时这种活性可以长久维持，与单靶点CAR-T和序贯输注2种CAR-T相比具有更优的抗肿瘤活性。

随着传统疗法和新型疗法的发展，MM的治疗已取得显著进展，然而难治和对硼替佐米耐药的情况仍然严重影响MM患者的预后。Shi等^[39]进行的一项自体造血干细胞移植(autologous hematopoietic stem cell transplantation，auto-HSCT)后序贯输注CD19-CAR-T和B细胞成熟抗原(B cell maturation antigen，BCMA)-CAR-T治疗9例难治高危MM患者的研究结果显示，患者接受auto-HSCT后14~20 d分别输注CD19-CAR-T和BCMA-CAR-T后，未发生严重细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome，CRS)或者慢性不良反应。全部9例患者中，4例患者经auto-HSCT后，骨髓微小残留病(minimal residual disease，MRD)呈阴性；其余5例经CAR-T治疗后，2例骨髓MRD呈阴性。auto-HSCT后有3例患者达完全缓解(complete remission，CR)，2例达非常好的部分缓解(very good partial remission，VGPR)，4例达部分缓解(partial remission，PR)，而这4例PR患者在经过后续CAR-T治疗后也达VGPR。随着中位随访时间的延长，所有患者的疗效均在持续改善中，达到长期疾病控制^[39]。

Chen等^[40]针对MM靶点SLAMF7/CS1构建由完整的BCMA-CAR和CS1-CAR通过自裂解P2A肽连接的复合型双靶点CAR-T。在不同CAR-T与K562细胞体外共培养实验的结果显示，2个单靶点CAR-T，即BCMA-CAR-T和CS1-CAR-T均不能完全清除残留K562细胞，而BCMA/CS1双靶点CAR-T可以完全将其清除。此外，MM小鼠模型实验结果显示，输注CAR-T后第10天，BCMA/CS1双靶点CAR-T较单靶点CAR-T对MM细胞的抑制速率快6%，并且在第12天时，达12%；接受BCMA-CAR-T和CS1-CAR-T治疗的小鼠生存期均≤30 d，而接受BCMA/CS1双靶点CAR-T治疗小鼠在第30天时仍能显示较高的生存率(P<0.05)，体内也可检测到BCMA/CS1双靶点CAR-T细胞的扩增^[40]。上述研究结果表明，与BCMA-CAR-T和CS1-CAR-T相比，BCMA/CS1双靶点CAR-T可使MM小鼠获得较好的存活，具有治疗MM的潜力，但是具体疗效有待进一步临床研究验证。

Lee等^[41]报道，一种新型CAR采用增殖诱导配体(a proliferation inducing ligand，APRIL)作为肿瘤靶向结构域，即APRIL-CAR或者ACAR。APRIL是BCMA及跨膜激活剂及钙调亲环素配体相互作用分子(transmembrane activator and calcium-modulating cyclophilin ligand interactor, TACI)的天然配体，具有非免疫原性和双特异性，是一种极具潜力的抗原结合剂，可以识别MM细胞上的BCMA和TACI。在体外实验中，ACAR-T细胞可在2 d内清除MM细胞。而与BCMA-CAR-T相比，在注射BCMA/TACI双靶点CAR-T的MM小鼠模型中，输注后第13天，ACAR-T能够完全清除BCMA⁺ TACI^-和BCMA^- TACI⁺细胞，而接受BCMA-CAR-T输注的小鼠体内肿瘤细胞持续存在(P<0.001)。上述研究结果表明，ACAR-T对BCMA和TACI具有双重靶向能力，有可能改善BCMA患者的临床反应，具有一定的临床应用潜力。

AML是一种高度异质性的髓系造血干细胞恶性增殖性疾病，是成年人中最常见的白血病。目前，AML的治疗以联合化疗及造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)为主，年龄<60岁AML患者的CR率可达70%~80%，AML老年患者可达50%。但是患者经治疗后总体生存(overall survival，OS)率仍不理想，其中>50%的AML患者最终复发；未接受HSCT的AML年轻患者5年OS率约为30%，而老年患者预后更差，获得长期生存的患者比例<10%；异基因HSCT(allogeneic HSCT，allo-HSCT)可一定程度上改善患者预后，但是移植后仍会面临较多的并发症^[42,43,44]。Petrov等^[19]设计了一种复合型CD123/CD33双靶点CAR-T，作为一种更全面的AML细胞消融策略，通过独立测试每个靶点(CD123^- CD33⁺或者CD123⁺ CD33^-)验证CD123/CD33双靶点CAR-T靶向多个抗原的能力。结果显示，在AML小鼠模型中，CD123/CD33双靶点CAR-T组在第6天较空白对照组的肿瘤负荷明显减少，而在第13天的肿瘤负荷较对照组降低92%~99%，双靶点CAR-T组的小鼠存活率亦较高(P＝0.008 2)。

白血病复发的根源在于白血病干细胞(leukemia stem cell, LSC)，残留LSC导致白血病无法被根除。传统的化疗手段不能清除LSC。Vyas等^[44]发现，C型凝集素样分子(C-type lectin-like molecule，CLL)-1主要存在于外周血和骨髓中性粒细胞、单核细胞、树突状细胞和大部分AML细胞，同时也表达于AML中大部分CD34⁺CD38^-LSC上，而在正常的CD34⁺CD38^-/CD33^-造血干细胞上不表达，在CD34⁺CD38⁺/CD33⁺造血祖细胞上表达。这提示，CLL-1具有作为AML理想治疗靶点的潜力。多项研究结果证实，CLL-1单克隆抗体治疗对AML细胞具有潜在杀伤作用^{[45,46,47,48]}。Liu等^[49]采用复合型CLL1/CD33双靶点CAR-T治疗1例复发/难治性AML患者的研究结果显示，患者治疗后第12天，AML细胞仍占骨髓的98%，而在第19天，患者MRD呈阴性，AML细胞被完全清除。该研究结果提示，CLL1/CD33双靶点CAR-T具有强大的抗AML活性，其具体疗效有待大样本、前瞻性临床研究进一步证实。

以CD19为靶点的CAR-T免疫疗法在治疗复发/难治性B-ALL的临床试验中显示出良好的疗效。然而由于靶向单一抗原的局限性，当发生抗原丢失或者表达水平下调，使肿瘤细胞缺乏能够结合到CAR中抗体的表面抗原，从而导致CAR-T治疗无效。与所有抗肿瘤药物类似，CAR-T需要在结构及治疗模式上进行不断的优化，从而实现疗效的提高。CAR-T产生细胞因子和杀伤肿瘤细胞的能力，主要依赖于靶抗原在肿瘤细胞表面的表达水平，单个靶点CAR-T难以满足高抗原密度的需求，难以被充分激活并发挥体内活性。在血液肿瘤抗原低表达及高异质性的条件下，重新设计多特异性和高活性的CAR-T是目前研究的重要策略之一。双靶点CAR-T可以扩大同类疾病中的靶向范围，降低肿瘤抗原突变逃逸的可能性，有效解决疾病复发、难治的问题。随着更多的肿瘤靶点的开发和应用，更多高效的、结构更优的CAR，以及多重抗原靶向策略将逐步成为CAR-T免疫疗法研究热点，以解决复发/难治性血液肿瘤的治疗难题，改善更多患者预后。