血液肿瘤是常见恶性肿瘤，目前大部分患者仍无法治愈，随着免疫治疗的发展，寻找新的治疗靶点成为目前血液肿瘤研究的热点之一。最近的研究发现，硫氧还蛋白(Trx)与血液肿瘤发生、发展密切相关。Trx是机体重要的氧化还原调节蛋白，广泛表达于人体组织细胞，通过清除活性氧簇(ROS)、结合对氧化还原敏感的蛋白，以及调节转录因子活性，保护细胞免受氧化损伤。Trx在多种血液肿瘤细胞中高表达，可促进肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞凋亡，导致肿瘤耐药。笔者拟就Trx的生物学功能、Trx在血液肿瘤发生、发展中的作用机制，以及Trx抑制剂在血液肿瘤治疗中的研究进展进行综述，旨在为探索血液肿瘤治疗的新靶点提供参考。
版权归中华医学会所有。
未经授权，不得转载、摘编本刊文章，不得使用本刊的版式设计。
除非特别声明，本刊刊出的所有文章不代表中华医学会和本刊编委会的观点。
活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)是细胞在生理和病理条件下产生的单电子产物，包括H2O2、超氧阴离子、羟基自由基等物质，线粒体氧化呼吸链是细胞内ROS的主要来源。在生理情况下，正常水平的ROS介导细胞的生长、增殖及分化过程，而ROS的大量积累可氧化DNA、蛋白质，造成细胞损伤，甚至凋亡、坏死[1,2]。人体内ROS水平的调节依靠多种氧化还原调节系统，其中最具代表的是硫氧还蛋白(thioredoxin，Trx)系统。Trx系统是一种二硫化物还原酶抗氧化系统，由Trx，Trx还原酶(Trx reductase, TrxR)和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)组成[3]。
Trx系统通过清除过多的ROS，保护细胞免受氧化损伤，在维持内环境氧化还原稳态及防止氧化应激方面发挥重要作用。氧化应激是多种肿瘤的共同特征，Trx系统通过发挥抗氧化作用参与肿瘤的发生，在多种肿瘤细胞中过表达[4]。除具有直接抗氧化活性外，Trx还能刺激细胞增殖，抑制细胞凋亡，激活转录因子，这对维持肿瘤细胞存活与增殖至关重要[5]。在急性白血病(acute leukemia，AL)细胞中Trx表达明显上调，Trx表达上调还与AL患者的不良预后相关。抑制Trx的表达可使白血病细胞对化疗药物敏感，克服白血病细胞对化疗药物的耐药性[6]。此外，Trx有可能是预测AL患者病情复发的生物学标志物[7]。Trx与血液肿瘤的发生、发展及耐药密切相关。因此，进一步研究Trx在血液肿瘤中的作用，不仅有助于提高对疾病发病机制的理解，而且有助于开发抑制Trx的靶向药物，改善治疗策略，提高疗效。
1964年，Reichard等首次从大肠埃希菌中发现一种为核糖核苷酸还原酶提供氢的小分子蛋白质，并将其命名为Trx，而且在随后的研究中发现，Trx广泛存在于真核生物及原核生物中[3]。人Trx由105个氨基酸残基组成，相对分子量为12×103，其氨基酸序列中含有5个活性半胱氨酸残基：Cys-32、-35、-62、-69、-73，其中Cys-32、-35是Trx氧化还原活性调节的中心位点，Cys-62、-69、-73可参与S亚硝基化、谷胱甘肽化等翻译后修饰，调节Trx活性[8]。
Trx包括3种不同亚型：Trx1~3。Trx1是该家族最重要的成员，表达于细胞质中，在应激情况下可转位至细胞核中发挥作用；Trx2表达于线粒体中，除包含Cys-32、-35氧化还原活性位点外，Trx2结构中还有一个N末端线粒体易位信号肽，该信号肽参与线粒体介导的细胞凋亡；Trx3则分布于男性生殖细胞内质网及高尔基体中，与精子的形成和功能有关[8]。此外，Trx1在翻译后修饰过程中，于N末端第80~84个氨基酸残基处发生断裂，形成一个相对分子质量为10×103的蛋白质，称为Trx80。Trx80缺乏氧化还原活性，但可诱导单核细胞产生白细胞介素(interleukin，IL)-12参与辅助性T细胞(helper T cell，Th)1免疫应答[6]。
TrxR是一种黄素腺嘌呤二聚体蛋白酶，由499个氨基酸残基组成，其N末端结构域包含一个高度保守的Cys59-Val-Asn-Val-Cly-Cys64氧化还原催化位点序列，可将Trx的二硫键还原成巯基，使Trx维持还原状态。其C末端结构域的倒数第2个氨基酸残基为硒代半胱氨酸(Sec498)，是多种TrxR抑制剂的作用位点[8]。与Trx相对应，TrxR也有3种不同的亚型TrxR1、TrxR2和TrxR3(又称为Trx谷胱甘肽还原酶)，分别是位于细胞质、线粒体和精子细胞中。TrxR不仅可以催化Trx的还原反应，而且还可以催化其他内源性或外源性物质的还原反应，在促进细胞增殖、调节细胞内氧化还原信号转导，以及肿瘤的发生中发挥重要的作用[9]。
细胞在机体生理及病理条件下，均可产生ROS，Trx通过清除过多的ROS，维持细胞的氧化还原稳态。Trx存在氧化型和还原型2种形式，还原型Trx通过与底物蛋白中的二硫键相互作用，将二硫键转换为巯基还原底物，发挥抗氧化功能，自身被转变为氧化态而失活。在TrxR的催化作用下，失活Trx的二硫键接受NADPH的氢原子还原为巯基，继而恢复活性[3]。
Trx与细胞核内定位因子相互作用转位至细胞核内，通过调控转录因子与DNA的结合，调节转录因子活性。Trx1可直接调节核因子-κB，氧化还原因子(redox factor，Ref)-1的活性[8]，还可通过Ref-1间接激活缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor，HIF)-1α，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的活性，进而发挥促增殖、抗凋亡作用[4]。
Trx对肿瘤的影响是双向的。在早期阶段，致癌因子激活和细胞新陈代谢增加，可使ROS的产生增多，导致氧化应激。为清除过多的ROS，细胞上调Trx表达水平，防止细胞发生癌变。然而，当正常细胞癌变以后，肿瘤细胞Trx水平升高，增强核糖核苷酸还原酶活性，促进DNA的合成，刺激肿瘤细胞增殖[8]。文献报道，Trx1不仅在结直肠癌[13]、宫颈癌[14]等实体瘤细胞中高表达，在血液肿瘤细胞中，Trx1的表达也明显升高。
Li等[15]研究发现，与健康个体(n＝25)的B细胞相比，弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)患者(n＝32)的B淋巴细胞中Trx1的表达水平显著升高(P<0.001)，而且DLBCL细胞系(n＝16)的Trx1表达水平较正常B细胞(n＝4)亦显著升高(P＝0.008)。此外，该研究者采用基因芯片技术分析240例DLBCL患者的Trx1表达发现，Trx1高表达患者(n＝112)的中位总体生存(overall survival，OS)期较Trx1低表达者(n＝128)显著缩短(2.5年比6.9年，P＝0.028)。Peroja等[16]评估106例接受R-CHOP(利妥昔单抗+环磷酰胺+多柔比星+长春新碱+泼尼松)方案治疗DLBCL患者病理活组织检查组织中，Trx蛋白表达水平对患者预后影响的研究结果显示，Trx蛋白高表达患者的5年无进展生存(progression-free survival，PFS)率为57.4%，低于Trx低表达者的85.1%，并且差异有统计学意义(P＝0.002)。这2项研究证明，Trx在DLBCL患者中高表达，而且与患者预后较差相关。
Raninga等[17]发现，多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)细胞系RPMI8226和U266细胞中Trx1的表达水平较健康个体浆细胞增高，并且证明高水平的Trx1通过增强核因子-κB的活性，促进MM细胞增殖。P Vassilakopoulos等[18]对174例霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma, HL)患者病变淋巴组织进行研究发现，Trx1不仅在肿瘤细胞中高表达，在肿瘤周边组织细胞中Trx1表达水平亦升高，提示Trx1可能在肿瘤微环境中发挥作用。此外，研究者在急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)和急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)细胞中，也观察到Trx的高表达[19,20]。Trx在血液肿瘤细胞中的表达明显上调，在肿瘤的发生中发挥重要作用，同时还可通过激活转录因子活性，促进肿瘤细胞的生长及存活。此外，Trx的高表达还与血液肿瘤患者预后不良有关，可能成为血液肿瘤诊断和预测患者预后的生物学标志物。
Trx可通过多种途径保护肿瘤细胞免于凋亡。凋亡信号调节激酶(apoptosis signal regulating kinase，ASK)1，通过激活下游c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)及p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路，诱导细胞凋亡。Zhou等[21]进行的体外细胞培养实验发现，抑制AML细胞系Kasumi-1细胞的Trx1活性，可激活下游ASK1/MAPK凋亡信号通路，促进白血病细胞凋亡。此外，Patwardhan等[22]在T细胞淋巴瘤小鼠模型中也发现，抑制Trx1表达可激活下游ASK1及Caspase-3蛋白的表达，从而促进肿瘤细胞凋亡。
磷酸肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB或Akt)信号通路是机体重要的信号通路，Akt通过磷酸化Caspase-9、-3，抑制其活性，进而抑制下游细胞凋亡反应。人10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homologs deleted on chromosome 10，PTEN)可将磷脂酰肌醇-(3，4，5)-三磷酸[phosphatidylinositol-(3，4，5)-trisphosphate，PIP3]转化为磷脂酰肌醇-(4，5)-二磷酸[phosphatidylinositol-(4，5)-biphosphate，PIP2]，从而抑制Akt的激活[23,24]。Shang等[25]通过对人胃癌细胞系BGC-823进行研究发现，过表达Trx1可导致PTEN蛋白水平降低和p-Akt水平升高，并且BGC-823细胞的凋亡明显减少，而沉默Trx1的表达可导致PTEN蛋白水平升高和p-Akt水平降低，以及细胞凋亡增多，这证明在胃癌细胞中，Trx1通过PTEN/Akt信号通路抑制细胞凋亡。对小鼠脑神经细胞瘤Neuro2a细胞的研究亦发现，抑制Trx可上调PTEN的表达水平，继而抑制Akt的活性，上调Neuro2a细胞的ROS水平和Caspase-3活性，可促进细胞凋亡[26]。对血液肿瘤细胞的研究发现，上调或下调ALL、DLBCL及MM细胞中PTEN的活性，可相应的促进或抑制肿瘤细胞凋亡[27,28,29]。但通过调节Trx活性，进而改变PTEN/Akt信号通路调控细胞的增殖及凋亡在血液肿瘤中仍需进一步探究。
Trx相互作用蛋白(Trx-interacting protein，TXNIP)，又被称为维生素D3上调蛋白(vitamin D3 up-regulated protein，VDUP)1，是Trx结合蛋白的家族成员。TXNIP的Cys-63、-247可与Trx活性中心位点的巯基相互作用，抑制Trx活性，进而促进肿瘤细胞凋亡[30]。在前列腺癌[31]、结肠癌[32]等实体瘤细胞中TXNIP的表达水平均减低。在AML、DLBCL和皮肤T细胞淋巴瘤等血液肿瘤细胞中，TXNIP的表达明显降低，而通过上调TXNIP的水平，可激活下游ASK1、JNK等凋亡信号通路，促进肿瘤细胞凋亡[33,34,35]。此外，Trx1还可通过上调组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)4的活性参与抗肿瘤细胞凋亡，HDAC4与肿瘤细胞的增殖有关，沉默HDAC4基因表达，可抑制MM细胞系LP-1的增殖，继而上调Caspase-9、-3蛋白的表达水平，诱导MM细胞凋亡[36]。综上所述，Trx主要通过抑制ASK1发挥抗凋亡作用，此外还可通过调节PTEN、TXNIP、HDAC4等转录因子的活性抑制细胞凋亡，Trx可能是治疗肿瘤极具潜力的靶点。
化疗药物可通过影响肿瘤细胞物质代谢、阻断细胞周期抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡、改变肿瘤微环境等途径发挥抗肿瘤作用。研究发现，Trx1的高表达与肿瘤细胞的耐药性相关。在肝癌hepG2细胞中，Trx-1促进HIF-1α表达，后者可上调多种糖酵解因子，激活糖酵解途径，促进肿瘤细胞增殖，导致肿瘤细胞对顺铂耐药[37]。在乳腺癌细胞系MCF-7中，Trx1增强激活蛋白(activating protein，AP)-1的转录活性，进而激活cyclinD1的转录，使被化疗药物阻滞于G1期的肿瘤细胞进入S期，促进肿瘤细胞增殖，导致MCF-7细胞对化疗药物耐药[38]。多西紫杉醇通过与β-微管蛋白结合稳定微管蛋白的结构，抑制肿瘤细胞有丝分裂，从而发挥抗肿瘤作用，Trx1可与微管蛋白二聚体中的二硫键结合，抑制微管组装，导致乳腺癌患者对多西紫杉醇耐药[39]。
Trx也参与血液肿瘤的化疗耐药，Trx在硼替佐米耐药的MM细胞中表达显著上调，抑制Trx可激活线粒体自噬，诱导对硼替佐米耐药的MM细胞凋亡[40]。对DLBCL细胞体外培养的研究发现，对多柔比星耐药的细胞系McA-DR比非耐药的McA细胞系具有更高的Trx1表达水平，通过小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)下调Trx1表达，可恢复McA-DR细胞系对多柔比星的敏感性[15]。但是也有研究发现，虽然Trx1高表达可导致DLBCL细胞对多柔比星耐药，但是同时可增强肿瘤细胞对依托泊苷的敏感性，这使对R-CHOP方案治疗不敏感的Trx1高表达DLBCL患者，可以考虑在R-CHOP方案中加入依托泊苷，即采用R-CHOEP方案治疗，然而具体疗效需进一步研究证实[41]。抑制Trx1还可增强AML细胞系U937对亚砷酸的敏感性，促进U937细胞凋亡[42]。此外，研究还发现，通过抑制TrxR的活性，可降低细胞内活性Trx水平，诱导ROS产生，使耐药的慢性粒细胞白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)细胞系K562/G01对伊马替尼敏感[43]。
Trx在多种肿瘤细胞中表达上调，针对Trx的药物正在研究中，其中最具潜力的是1-甲基丙基-2-咪唑基二硫化物(1-methylpropyl-2-imidazolyl disulfide，PX-12)。PX-12是美国ProlX Pharmaceuticals公司研发、生产的Trx1抑制剂，PX-12通过与Trx1的Cys-73结合，形成二硫化合物，从而不可逆的抑制Trx1的活性[44]。林全德等[45]研究发现，在MM细胞系H929中，PX-12与硼替佐米联合使用，可诱导细胞周期阻滞在G2/M期，抑制MM细胞增殖，PX-12还可通过增加ROS水平，促进MM细胞凋亡。在对急性淋巴母细胞白血病细胞的研究结果显示，PX-12可增强促凋亡蛋白B细胞淋巴瘤/白血病因子(B-cell lymphoma/leukemia，BCL)-2相关X蛋白(BCL-2 associated X protein，BAX)和BCL-2拮抗杀伤蛋白(BCL-2-antagonist-killer protein，BAK)的表达，并且增加线粒体膜的通透性，引起线粒体凋亡因子的释放，诱导肿瘤细胞死亡[46]。研究发现，PX-12在一项针对难治性晚期恶性肿瘤的Ⅰ期临床试验中显示出一定疗效，有望用于临床治疗[47]。伏立诺他(vorinostat, MK-0683, SAHA)是一种HDAC抑制剂，是首个被美国食品和药物监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准用于治疗皮肤T细胞淋巴瘤(cutaneous T-cell lymphoma，CTCL)的HDAC抑制剂[48]。研究发现，SAHA可下调肺癌细胞中Trx1的mRNA和蛋白水平，导致ASK激活，通过触发ASK/JNK和ASK/p38MAPK信号通路诱导肿瘤细胞凋亡[49]。SAHA亦被纳入骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes，MDS)和AML的Ⅰ期临床试验(NCT03843528)，并且初步研究结果已证实该药具有很好的临床应用前景[50]。
与Trx抑制剂相比，目前报道更多的是TrxR抑制剂，其通过抑制TrxR的活性，间接抑制Trx的功能，发挥抗肿瘤作用，靶向抑制TrxR是治疗肿瘤的一种很有临床应用前景的策略。目前报道的大部分TrxR抑制剂，均为基于其C末端结构域Sec498亲核性或金属亲和性开发的，主要包括天然产物及其合成类似物和金属离子金或铂的配合物[51]。天然产物及其合成类似物无毒且不良反应小，具有很好的临床应用价值，姜黄素是从植物姜黄中提取的天然多酚化合物，具有抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡作用。研究发现，姜黄素通过降低TrxR的表达水平，进而增加乳腺癌细胞对化疗和放疗的敏感性[52,53]。Dai等[54]设计并合成一组姜黄素类似物，并研究其对肺癌A549细胞的影响。结果显示，A549细胞中TrxR活性显著下降，ROS水平显著升高，导致细胞凋亡增加。此外，黄酮类化合物、萜类化合物、醌类化合物也可抑制TrxR的活性，发挥抗肿瘤作用[55]。金属配合物对TrxR的抑制作用强于天然化合物，金诺芬(auranofin)是最先被报道的强效TrxR抑制剂，目前已被批准用于风湿免疫性疾病的治疗，研究还发现金诺芬对慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)具有临床前疗效，已经在CLL患者中进行了Ⅰ/Ⅱ期临床试验(NCT01419691)[20]。含铂的配合物长期以来一直用于恶性肿瘤的化疗，研究发现含铂配合物Pt(pCPIP)Cl2可抑制TrxR的活性，激活下游p38MAPK信号通路，并且下调Akt活性，抑制肿瘤细胞增殖及存活[56]。Trx及TrxR抑制剂具有潜在的临床应用价值，目前多种Trx/TrxR抑制剂正在进行临床试验，未来有望单独或与其他药物联合用于治疗血液肿瘤。
对化疗药物耐药是血液肿瘤治疗面临的巨大挑战，克服肿瘤耐药性提高抗肿瘤疗效，是目前亟需解决的问题。Trx是重要的氧化还原调节蛋白，参与机体抗氧化应激，维持氧化还原稳态，在实体瘤与血液肿瘤细胞中的表达升高，参与肿瘤的发生、发展和耐药。多项临床研究已经阐明，Trx系统在致癌及耐药过程中发挥关键作用，使该系统成为开发抗癌药物的一个潜在靶点。Trx及TrxR的抑制剂作为肿瘤疾病的治疗药物，引起相关研究者的广泛关注，但是未来该领域的研究仍面临以下挑战：①Trx在正常细胞及肿瘤细胞均表达，因此开发只针对肿瘤细胞而对正常细胞影响较小的抑制剂至关重要；②虽然已经报道多种Trx系统抑制剂，但能特异性抑制Trx和TrxR的药物很罕见。大多数Trx系统抑制剂因为严重不良作用未能进入临床治疗，所以仍需进一步探索Trx及TrxR抑制剂的作用机制。未来，可进一步探讨Trx及TrxR抑制剂与其他化疗药物联合使用的可能性，以期进一步提高血液肿瘤的疗效。
所有作者声明无利益冲突
