急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)是一种起源于前体T细胞(pre-T)的血液肿瘤，恶性程度高，复发/难治性T-ALL患者预后极差，亟待进一步寻求更有效的治疗。经典Wnt信号通路异常激活广泛存在于T-ALL之中，该信号通路可通过诱导下游靶基因转录，导致T细胞发生恶性转化或促进肿瘤细胞增殖、分化、转移，参与T-ALL的发病过程。笔者拟就经典Wnt信号通路在T-ALL中的异常激活及其在T-ALL发病机制中的研究现状进行介绍，为探索更安全有效的治疗方案，并进一步改善复发/难治性T-ALL患者的预后及生存提供参考。
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急性T淋巴细胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia，T-ALL)是一种起源于前体T细胞(T lineage precursor，pre-T)的血液肿瘤，分别占儿童和成年人急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)的15%和25%，主要表现为幼稚或者不成熟T细胞的异常克隆增殖，并浸润于骨髓、血液或其他组织和器官，导致骨髓造血功能异常及免疫功能紊乱，通常与染色体易位及参与T细胞发育的关键基因突变相关[1,2]。目前，T-ALL的临床治疗以联合化疗为主，但是多数患者接受大剂量化疗后仍发生复发，且复发者预后差，长期生存率低。因此，进一步明确T-ALL的发生、发展过程，寻找新的治疗靶点，开发更安全有效的药物成为临床研究的热点。越来越多的研究证据表明，经典Wnt信号通路在维持造血干细胞(hematopoietic stem cell，HSC)自我更新和定向分化之间的平衡过程中发挥重要作用，该信号通路的异常激活可能是诱导血液肿瘤发病的基础[3]。笔者拟对经典Wnt信号通路在T-ALL中的异常激活及其在T-ALL发病机制中的作用进行总结，旨在为复发/难治性T-ALL的靶向治疗提供新思路。
Wnt信号通路是一类进化高度保守的信号通路，可通过Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)、Wnt/PCP及Wnt/Ca2+3个信号通路执行不同的功能。其中Wnt/β-catenin信号通路，也称为经典Wnt信号通路，是目前研究最多，也是与肿瘤发生、发展关系最为密切的信号通路[4]。经典Wnt信号通路主要包括Wnt蛋白，跨膜受体蛋白[卷曲蛋白(frizzled，FZD)家族受体与低密度脂蛋白相关受体蛋白(low density lipoprotein receptor-related protein，LRP)5/6受体]，细胞质内β-catenin，酪蛋白激酶(casein kinase，CK)，蓬乱蛋白(dishevelled，DVL)，糖原合成激酶(glycogen synthase kinase，GSK)3-β，结肠腺瘤息肉易感蛋白(adenomatous polyposis coil，APC)，Axin蛋白等信号蛋白，以及转录因子T细胞因子(T cell factor，TCF)/淋巴样增强因子(lymphoid enhancer factor，LEF)家族等。
经典Wnt信号通路由Wnt蛋白激活，当Wnt蛋白与跨膜受体特异性结合后激活DVL，活化的DVL可以通过抑制GSK3-β防止β-catenin被磷酸化降解，β-catenin在细胞质内大量积聚并向细胞核转运，在细胞核内与转录因子TCF/LEF形成复合体，引起下游c-MYC、AXIN2、DKK1、cyclin D1、MMP-7、E-cadherin等一系列核内靶基因的转录，最终导致细胞的异常增殖及组织分化，与血液肿瘤的发生、发展关系密切[5]。已有研究发现，Wnt/β-catenin信号通路的异常激活存在于白血病、淋巴瘤及多发性骨髓瘤(mutiple myeloma，MM)等多种血液肿瘤中[6]。经典Wnt信号通路是一个复杂的调控网络，其与HSC的自我更新、增殖、分化、凋亡及胚胎早期发育和组织再生等密切相关，深入研究该信号通路与肿瘤之间的关系，能够为肿瘤治疗提供参考。
经典Wnt信号通路可以概括为Wnt蛋白与FZD受体蛋白结合，导致细胞质内β-catenin积聚，并转移至细胞核与TCF/LEF结合，进而引起靶基因转录。β-catenin作为信号通路中连接细胞内、外信号的关键枢纽，其表达水平升高通常被认为是该信号通路异常激活的标志，受自身β-catenin编码基因突变及上游Wnt、GSK3-β、APC、Axin等蛋白的调控。经典Wnt信号通路异常激活广泛存在于T-ALL中。Zhang等[7]采用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)分别对40例T-ALL患者及40例健康志愿者体内的β-catenin表达水平进行定量分析的结果显示，T-ALL患者体内的β-catenin表达水平显著高于健康志愿者(P<0.000 1)。此外，Erbilgin等[8]研究发现，与其他白血病患者(n＝48)相比，超过85%的T-ALL患儿(n＝129)中存在β-catenin的表达水平增加。不仅如此，目前也有研究发现，在部分T-ALL患者中可以检测出CTNNB(编码β-catenin)、AXIN1(编码Axin蛋白)、APC(编码APC蛋白)、LEF1(编码LEF1蛋白)等基因突变，且携带突变基因患者体内的β-catenin mRNA水平或蛋白表达水平均较健康个体有所升高[9,10,11]。这提示，经典Wnt信号通路的异常激活在T-ALL发病过程中具有重要作用，因此进一步探索经典Wnt信号通路在T-ALL发病机制中的作用，有助于探索复发/难治性T-ALL的治疗新靶点。
T-ALL中经典Wnt信号通路的异常激活可由Wnt蛋白/FZD受体的异常高表达、编码关键信号蛋白的基因突变及表观遗传学异常引起[12]。Groen等[13]将缺乏自分泌功能的CEM和Molt4细胞(T-ALL细胞系)采用含与不含高水平Wnt蛋白/FZD受体的培养基培养，分别作为实验组与对照组，并通过蛋白印迹及荧光素酶测定的方法分别检测2组细胞β-catenin表达水平及TCF转录活性，结果显示，与对照组比较，实验组细胞内的β-catenin表达水平显著增高(P<0.01)，TCF介导的基因转录和T-ALL细胞的生长活性约为对照细胞的2倍(P<0.05)。同时，该实验还采用CTNNB(编码β-catenin)突变基因转染CEM和Molt4细胞，结果显示，转染后细胞内TCF转录活性明显增强(P<0.001)。该研究结果证实，经典Wnt信号通路不仅可以由Wnt蛋白/FZD受体的异常高表达激活，也可以由信号通路中编码关键蛋白的基因突变激活。此外，Zhou等[14]研究发现，T-ALL细胞存在分泌型卷曲相关蛋白(secreted frizzled related protein，SFRP)1/2/5，性别决定区Y-box蛋白(sex determining region Y-box，SOX)17，钙黏蛋白(cadherin，CDH)1等Wnt信号通路抑制基因启动子高甲基化，当抑制基因发生启动子高甲基化时可与甲基化CpG结合域蛋白(methyl-CpG binding domain protein，MBD)2结合，使Wnt拮抗剂转录水平减低，进而引起T-ALL细胞内β-catenin表达水平升高、下游靶基因转录活性增强，间接激活Wnt信号通路。这提示，Wnt信号通路中关键调节子的异常表观遗传修饰也可间接激活Wnt信号通路。
HSC是一类具有自我更新及定向分化能力的多能干细胞，能够分化为所有成熟血细胞[15]。骨髓HSC定向分化的祖T细胞(T lineage progenitor，pro-T)在胸腺中发育成熟，并最终进入外周血及淋巴组织发挥特异细胞免疫和免疫调节功能，这一过程受到包括经典Wnt信号通路在内的多种信号的调控及诱导[16]，当T细胞发育受到阻滞或者发生异常转化时则可诱导肿瘤的产生。大量研究结果表明，经典Wnt信号通路中各信号蛋白的编码基因突变或者表达水平异常可以通过阻滞T细胞的发育，进而诱导T-ALL细胞的形成，也可以通过调节T-ALL细胞的增殖、分化及迁移参与T-ALL的发生、发展。因此，从不同角度分析经典Wnt信号通路在T-ALL发病机制中的作用，可能对临床上T-ALL的诊断及治疗提供新的思路。
在胸腺微环境的影响下，T细胞的发育需经历淋巴祖细胞，pro-T，pre-T，未成熟T细胞，成熟T细胞的阶段，不同阶段T细胞表达不同的免疫表型和功能。而依据CD4和CD8的表达，T细胞又可分为双阴性T细胞(double-negative T cell，DN)，双阳性T细胞(double-positive T cell，DP)和单阳性T细胞(single positive T cell，SP)这3个阶段。胸腺T细胞发育过程中需要严格控制β-catenin表达水平[17]。小鼠实验发现，β-catenin在DN3阶段表达水平达到最高，并通过与TCF1结合调控IL-7R，EGR和RORγt基因的转录水平，进而诱导DN向DP发育阶段转变，随后β-catenin表达水平在前体DP中稳定下降。若β-catenin表达水平未能及时下调则可导致DN发育阻滞，进而诱导T-ALL细胞的产生[17]。
Guo等[18]利用T细胞特异Cre转基因小鼠[B6.Tg(Lck-cre)]与CTNNB小鼠(存在CTNNB基因显性突变小鼠)杂交构建出DN3阶段高表达β-catenin且不能自动下调其表达水平的小鼠模型，然后移植白血病细胞诱导小鼠发生白血病。该研究结果显示，杂交小鼠的T-ALL发病率为66%(13/20)，中位潜伏期为114 d，且发病小鼠的淋巴瘤细胞免疫表型与DP免疫表型相似。该研究结果证实，持续高表达的β-catenin能够阻碍DN向DP发育，并使其发生恶性转化。此外，Kaveri等[19]以R26-βcat小鼠(Cre-LoxP重组酶系统调控T细胞CTNNB基因表达纯合子小鼠)为模型(在整个T细胞发育过程中均保持高表达水平的β-catenin)进一步验证经典Wnt信号通路对诱导T-ALL发生的作用，结果显示，与不存在CTNNB基因表达的对照组小鼠(n＝50)相比，R26-βcat小鼠(n＝44)更容易在DN-DP阶段发生阻滞，且所有R26-βcat小鼠在5~6个月后均发展为T-ALL。因此，对于在整个胸腺T细胞发育中β-catenin持续高表达的T-ALL患者而言，通过靶向增强β-catenin的磷酸化降解，及时下调β-catenin表达水平，可能有助于诱导DN正常发育为DP，防止T-ALL细胞的产生。
表达水平异常增高的Wnt蛋白/FZD受体可通过激活经典Wnt信号通路下游靶基因的转录，进而促进T-ALL细胞增殖。目前在T-ALL细胞中已发现Wnt1、Wnt3、Wnt3a、Wnt10B、Wnt16蛋白及FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD10受体的异常高表达[20,21]。研究结果表明，Wnt3a蛋白介导的信号通路可通过促进靶基因cyclin D1的转录调控白血病细胞的增殖[22]。cyclin D1目前已在乳腺癌、膀胱癌、淋巴瘤等多种肿瘤中被发现，是原癌基因，该基因的过度表达可促进肿瘤细胞周期由G1期进入S期，促进细胞有丝分裂[23]。采用流式细胞术分别对乙烷亚硝基脲诱导的T-ALL组(n＝30)及生理盐水处理的对照组小鼠(n＝30)Wnt3a、FZD7及β-catenin平均荧光强度(mean fluorescence intensity，MFI)进行检测发现，与对照组小鼠相比，T-ALL组小鼠的Wnt3a[(41.28±0.88)比(61.07±1.09)，P<0.000 1]，FZD7[(18.25±3.55)比(28.18±3.16)，P<0.05]，β-catenin[(89.39±2.77)比(106.11±6.42)，P<0.05]表达水平均增高。该研究结果表明，经典Wnt信号通路在T-ALL中异常激活[22]。为了进一步验证其作用，该实验将经乙烷亚硝基脲诱导第180天的T-ALL小鼠模型骨髓细胞分别接种在含或不含Wnt3a抗体培养基中，结果显示，含Wnt3a抗体的培养基中白血病干细胞(leukemia stem cell，LSC)集落的数量较不含Wnt3a抗体的对照组减少约50%。这提示，经典Wnt信号通路与T-ALL的增殖密切相关。
此外，一项意大利的研究利用靶向RNA测序技术发现T-ALL患者中由WNT10B基因突变而异常激活的Wnt10B/FZD6/β-catenin/PLCB4，PROM1，LRP5，MLLT11，PLAU信号通路[24]。为了探究该信号通路对T-ALL的影响，研究者以异常高表达Wnt10B蛋白的MOLT-4细胞系为模型，采用豪猪碱抑制剂(可抑制Wnt蛋白与FZD6受体复合物的形成)及转化生长因子-β抑制剂(可下调FZD6表达水平)处理细胞。该研究结果显示，与不采用豪猪碱抑制剂的对照组相比，加入豪猪碱抑制剂的MOLT-4细胞下游PLCB4、PROM1、LRP5、MLLT11、PLAU等基因的转录活性(P<0.001)及细胞的增殖活性均显著减低(P<0.05)。该研究结果证实，异常激活的经典Wnt信号通路可通过增加下游靶基因的转录促进T-ALL细胞的增殖，参与T-ALL的发病机制，而采用拮抗Wnt蛋白/FZD受体复合物形成的方式阻断信号通路转导，减少靶基因过表达，抑制T-ALL细胞增殖，有望成为T-ALL治疗的新靶标。
根据T-ALL细胞在不同分化阶段的免疫表型，欧洲白血病免疫学分型协作组(European group for immunological characterization of acute leukemias，EGIL)将T-ALL分为早期前T-ALL(CD7+)、前T-ALL[CD2+和(或)CD5+和(或)CD8+]、皮质T-ALL(CD1a+)及成熟T-ALL(细胞膜CD3+，CD1a－)等亚型，为T-ALL的免疫分型奠定了基础[25]。TCF是经典Wnt信号通路的下游信号蛋白，由TCF7基因编码，该基因发生改变可异常激活经典Wnt信号通路，与T-ALL细胞的分化密切相关。
Seki等[26]在7例伴NRAS突变T-ALL患者中发现，3例患者同时携带TCF7-SPI1融合基因，且携带该融合基因患者的T-ALL细胞免疫表型与DN3和DN4类似，免疫分型介于早期前T-ALL与前T-ALL之间。为了进一步明确该基因与T-ALL细胞分化的关系，Van Thillo等[27]分别比较了接受伴NRAS突变骨髓移植小鼠(n＝9)和接受伴TCF7-SPI1-P2A-NRAS融合基因骨髓移植小鼠(n＝9)的情况，虽然二者最终均发展为T-ALL，但携带TCF7-SPI1-P2A-NRAS融合基因的小鼠表现为诱导分化程度更低的T-ALL细胞亚型(CD4－、CD8－、CD3+、CD117+)。因此，研究者通过选择性地去除构成β-catenin结合位点的前55个氨基酸破坏伴TCF7-SPI1-P2A-NRAS融合基因小鼠中TCF1与β-catenin的结合结构域，阻止经典Wnt信号通路的继续转导，结果发现，伴TCF7-SPI1-P2A-NRAS融合基因小鼠中T-ALL细胞表型与伴NRAS突变小鼠中分化程度相对成熟的T-ALL细胞表型(CD4+、CD8+)一致。该研究结果证实，TCF7基因异常引起的经典Wnt信号通路激活可参与调控T-ALL的分化。此外，Bigas等[28]通过对高通量基因表达数据库的筛选与分析，评估了不同T-ALL患者中CTNNB、LEF1、TCF7、AXIN2等基因的表达水平及其治疗反应，结果显示，在分化程度较低的T-ALL亚型中CTNNB表达水平显著升高，而LEF1表达水平则较低，通常这一类患者对治疗无反应或反应较差。因此，Wnt家族成员基因的异常改变可能与T-ALL亚型和(或)治疗结果相关，深入了解T-ALL中经典Wnt信号通路及其家族成员基因的分子学特点，能为制定更好的风险分层和靶向治疗提供新方向。
LSC是一类具有不对称分裂和自我更新能力的肿瘤干细胞，对T-ALL的转移具有重要作用。多项小鼠体内实验研究发现，在Notch1诱导的T-ALL小鼠骨髓中，存在少量具有Wnt活性的LSC亚群，而且通过条件RNA干扰使CTNNB基因失活，可显著减少LSC的数量[29,30]。为了探索经典Wnt信号通路与T-ALL的关系，Giambra等[30]在体外将Wnt实时荧光报告基因构建体转导T-ALL细胞，最后将转导后的T-ALL细胞通过尾静脉注射至健康小鼠中，待小鼠发展为T-ALL后检测其体内荧光活性。结果显示，T-ALL小鼠骨髓中存在1.6%带荧光活性的白血病细胞，而且小鼠脾内白血病细胞也具有同样的荧光活性。这表明，经典Wnt信号通路在T-ALL细胞的转移中发挥重要作用。此外，Zhang等[7]将β-catenin表达水平异常增高的T-ALL患者的骨髓白血病细胞采用流式细胞术分选为β-catenin阳性和β-catenin阴性细胞，并将其分别注射至NSG小鼠体内，结果发现，所有注射β-catenin阳性细胞组(n＝6)小鼠均出现T-ALL的肝转移，而注射β-catenin阴性细胞组(n＝6)小鼠则没有发生肝转移。该研究结果进一步证实，T-ALL的转移可通过骨髓中小部分具有Wnt活性的LSC不对称分裂实现，更重要的是，通过降低β-catenin的表达水平进而减少具有Wnt活性的LSC数量可能对延缓T-ALL进展具有重要意义，值得进一步研究探索。
经典Wnt信号通路与肿瘤的发生、发展密切相关，靶向抑制经典Wnt信号通路一直是临床研究热点。临床研究中调节Wnt信号通路的靶向疗法多种多样，根据经典Wnt信号通路的关键环节，大致可分为Wnt蛋白拮抗剂、Wnt蛋白/FZD受体复合物抑制剂、β-catenin抑制剂、TCF/β-catenin抑制剂等。目前实体肿瘤相关研究中已有3种Wnt蛋白拮抗剂，8种Wnt蛋白/FZD受体复合物抑制剂及2种β-catenin抑制剂进入Ⅰ期临床试验阶段，2种TCF/β-catenin抑制剂等进入Ⅱ期临床试验阶段[31]，而在血液系统肿瘤研究中也有2种β-catenin抑制分别进入急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)和MM的Ⅰ期临床试验阶段，但是有关T-ALL方面的研究仍处于基础实验阶段，有待进一步探索[32]。
LGK974[24](Wnt蛋白/FZD受体复合物抑制剂)可通过阻止Wnt蛋白与FZD受体特异性结合拮抗经典Wnt信号通路，用于治疗Wnt蛋白表达水平异常升高的恶性肿瘤，目前已进入多种实体肿瘤的Ⅰ期临床试验阶段，也被证明可以显著抑制T-ALL细胞的增殖，并增加其凋亡。ICG-001(TCF/β-catenin抑制剂)，可与TCF上的CREB结合蛋白特异性结合，阻断β-catenin引起的靶基因转录，进而抑制T-ALL细胞的增殖、分化及转移[33,34]。此外，也有研究者提出可以尝试使用去甲基化药物[35]增加Wnt拮抗剂的转录水平，进而拮抗Wnt信号通路的异常激活，诱导T-ALL肿瘤细胞凋亡，为复发/难治性T-ALL提供了新的治疗策略。但是上述药物在治疗T-ALL中的疗效及安全性有待进一步研究。
总之，使用拮抗Wnt/β-catenin信号通路异常激活的药物有望改善T-ALL患者疗效，特别是对于常规化疗难治或者化疗后复发的患者。但是经典Wnt信号通路在T-ALL发病机制中的作用非常复杂，其关键调控环节、多个信号分子之间的联系仍不明确，其能否有效应用于临床治疗，还有待进一步研究证实。
T-ALL是一种常见的侵袭性血液肿瘤，复发/难治性患者的预后差，需要进一步开发研究更有效的靶向治疗。Wnt/β-catenin信号通路的异常激活与T-ALL的发病相关，并且可能与T-ALL的耐药性及侵袭性相关。因此，进一步开发拮抗Wnt/β-catenin信号通路的药物为靶向治疗复发/难治性T-ALL提供了可能性。虽然已有大量临床试验致力于研究通过抑制Wnt/β-catenin信号通路进一步靶向治疗T-ALL，但是Wnt信号通路是一个复杂的调控网络，其调控T-ALL发生、发展的关键环节及具体机制仍不明确，仍需要进行大量的实验研究。深入研究Wnt信号通路在T-ALL发生、发展中的作用，也将对T-ALL的靶向治疗提供新的方向和思路，对提高复发/难治性T-ALL患者的预后及生存具有重要意义。
所有作者声明无利益冲突
