近年，心脑血管血栓性疾病的发生率逐年增高，而引起血栓性疾病的首要原因是病理性血栓的形成。血小板在止血和血栓形成中发挥重要作用。整合素αⅡbβ3是血小板表面表达最丰富的受体，且是血小板活化聚集的终末通路。整合素αⅡbβ3拮抗剂，如阿昔单抗、依替巴肽及替罗非班，具有抑制血栓形成作用，但其在抗血栓的同时可导致严重出血，因此如何在抗血栓的同时降低出血发生率是相关研究热点。整合素αⅡbβ3可介导血小板双向信号转导，因此研发新型拮抗剂，选择性地阻断细胞外向细胞内信号转导而不影响细胞内向细胞外信号转导，可发挥抗血栓作用而不导致出血，是新的抗血栓策略。笔者拟重点对整合素αⅡbβ3及其在血小板相关信号通路中的作用，以及各种靶向整合素αⅡbβ3的抗血栓药物进行介绍，为临床抗血栓治疗提供新思路。
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目前，心脑血管血栓性疾病是致死率首位的疾病，而引起血栓性疾病的首要原因是病理性血栓形成。血小板在止血和血栓形成中发挥重要作用，主要通过其表面的受体，特别是整合素类实现其生理功能。整合素是机体生理、病理过程中，细胞基质和细胞间黏附的关键介质。整合素由α、β亚单位通过非共价键结合而成，在哺乳动物中，18种α亚单位和8种β亚单位组合形成24种整合素异源二聚体，在细胞黏附、伸展、迁移、发育、增殖及止血等过程中发挥重要作用。
整合素αⅡbβ3是血小板表面表达最丰富且重要的受体，所有可在体内发挥作用的激动剂，如ADP、肾上腺素、凝血酶等诱导的血小板聚集均需要该受体的参与[1]。因此，整合素αⅡbβ3是不同激动剂诱导血小板活化、聚集的最终共同途径，在血小板活化、初期止血及稳定性血栓的形成过程中发挥关键作用。多种细胞内信号分子，如talin、kindlin、G13α参与整合素αⅡbβ3活化调控。靶向整合素αⅡbβ3的拮抗剂可有效抑制整合素αⅡbβ3活化，发挥抗血栓作用。笔者拟重点对整合素αⅡbβ3及其在血小板相关信号通路中的作用，以及各种靶向整合素αⅡbβ3的抗血栓药物进行介绍，为临床抗血栓治疗提供新的思路。
整合素是一种跨膜细胞黏附分子受体，静息状态下呈屈曲状态，与配体亲和力低，当血小板受刺激时，整合素细胞外结构域(extracellular domain，ECD)构象发生变化，从屈曲状态变为伸展状态，与配体的亲和力由低转换到高，这个过程称为整合素的激活，即细胞内向外细胞信号转导[1]。活化的整合素αⅡbβ3结合配体后，信号由细胞外转向细胞内，引起一系列后续反应[2]。整合素参与组织发育、细胞迁移、血管生长、损伤修复、血栓形成、炎症反应等病理、生理过程。
整合素是一个庞大的细胞表面受体家族，目前在不同的细胞表面发现24余种整合素[3]。整合素作为一类跨膜糖蛋白受体，是由α亚基和β亚基通过非共价键结合形成的异源二聚体，包括一个体积大的ECD，一个单一的跨膜结构域(transmembrane domain，TMD)和一个较短的细胞质尾部(cytoplasmic tail，CT)[4]。ECD与细胞外配体相互结合，TMD为穿膜段，CT通常与细胞内部分适配器分子结合以促进细胞内、外双向信号转导。目前，研究发现，在血小板表面上存在5种整合素表达，包括整合素αⅡbβ3、整合素αvβ3、整合素α2β1、整合素α5β1及整合素α6β1[5]，分别结合纤维蛋白原、玻连蛋白、胶原、纤维连接蛋白及层黏连蛋白。
目前对表达于血小板和巨核细胞表面的整合素，研究深入的是整合素αⅡbβ3。整合素αⅡbβ3，也被称为糖蛋白Ⅱb/Ⅲa (CD41/CD61)复合物，是血小板膜表面最丰富的糖蛋白，约占血小板总膜蛋白的17%[6]，是不同激动剂诱导血小板活化、聚集的最终共同途径。αⅡb亚基跨膜段是一个垂直于细胞膜的线性α螺旋结构，连接一个主链的拐角区；β3亚基的跨膜段也是一个线性α螺旋结构，长于磷脂双分子层，与细胞膜的夹角<90°，与αⅡb亚基形成25°夹角[1]。与αⅡb亚基相比，β3亚基更保守，在信号转导过程及与细胞内蛋白相互作用过程中发挥更为关键的作用。整合素αⅡbβ3具有3种不同的构象：弯曲闭合、伸展闭合和伸展打开。整合素活化需要从低亲和力(弯曲闭合)到高亲和力(伸展打开)的构象转变[7]。在静息状态下，整合素αⅡbβ3与配体亲和力较低，处于低亲和力状态。当血管内皮细胞受损后，受损血管内皮下暴露的胶原与血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)结合，vWF进一步通过其A1区与血小板表面的糖蛋白Ⅰb/Ⅸ结合，使血小板"抛锚"于血管内壁，并在血流的冲击下呈滚动性黏附；同时，vWF与糖蛋白Ⅰb/Ⅸ相互作用的信号传出血小板，导致整合素αⅡbβ3 ECD构象改变，从屈曲状态变为伸展状态，与配体的亲和力增加，这也称为整合素αⅡbβ3的细胞内向细胞外信号转导。这一过程的标志性事件为血小板的不稳定性黏附、血小板与游离纤维蛋白原的结合，以及血小板间的可逆聚集。活化的整合素αⅡbβ3与配体结合后可再引起一系列后续反应，如蛋白质磷酸化、钙流变化和血小板内含物的释放等，表现为血小板的稳定黏附、伸展、第二相聚集、颗粒释放、血块回缩等事件的发生，即细胞外向细胞内信号转导，最终导致稳定血栓的形成。在上述过程中，多种细胞内信号分子与整合素αⅡbβ3的CT相互作用，参与调节整合素αⅡbβ3的细胞内、外双向信号转导[8,9]。
部分细胞内信号分子可结合整合素αⅡbβ3的CT，促进细胞内、外双向信号转导，这是血栓形成和止血的关键。在不影响止血的情况下，通过空间或时间上干扰整合素αⅡbβ3与细胞内信号分子的相互作用，抑制血栓形成是开发安全抗血栓药物的极具潜力的策略之一。这些相关细胞内信号分子包括talin、kindlin、c-Src及Gα13。
Talin是最早被发现的与整合素αⅡbβ3相互作用的信号蛋白，其N端具有一个含FERM(4.1-protein/ezrin/radixin/moesin)结构球状头部，C端具有一个可弯曲的杆部。FERM由3个亚单位F1、F2、F3组成，F3亚单位类似一个磷酸酪氨酸结合(phosphate tyrosine binding，PTB)区域，为整合素第1结合位点(integrin first binding site，IBS1)，可结合整合素αⅡbβ3 CT近膜天冬酰胺-脯氨酸-亮氨酸-酪氨酸(asparagine-proline-leucine-tyrosine，NPLY)模序；talin的杆部具有多个黏着斑蛋白(vinculin)结合位点和整合素第2结合位点(integrin second binding site，IBS2)，C端包含talin-HIP1/R/Sla2p肌动蛋白(actin)链C端同源性(talin-HIP1/R/Sla2p actin-tethering C-terminal homology，THATCH)区域，介导二聚化并直接介导talin和肌动蛋白之间的联接[10]。
Talin包括talin1和talin2，以活化和非活化形式存在。位于talin头部的IBS1参与整合素活化；位于talin杆部IBS2为连接整合素β亚基与肌动蛋白(包括actin、vinculin等)所必需[11,12]。整合素转变为高亲和状态，仅需talin头部，但整合素异源二聚体相互作用形成异源寡聚体的过程，即成簇形成黏着斑(focal adhesion)的过程，需要全长的talin[13]。talin可作为整合素的交联因子促进整合素成簇。talin的杆部包括多个vinculin结合位点，vinculin能连接肌动蛋白，因此可增强整合素和细胞骨架之间的连接[14,15]。
黏着斑是形态学上分布于细胞中央及细胞外围的点状结构[12]，其形成是整合素αⅡbβ3细胞外向细胞内信号转导的标志性事件，在细胞伸展中发挥重要作用。黏着斑组成复杂，整合素αⅡbβ3和肌动蛋白是其最重要的组成部分。在血小板整合素αⅡbβ3活化过程中，肌动蛋白可以转化成纤维丝驱动细胞伸展[16]。
由于整合素αⅡbβ3没有肌动蛋白的结合位点，整合素αⅡbβ3与肌动蛋白的连接必须依靠募集至黏着斑处的与整合素细胞质段直接结合的细胞内蛋白参与完成。在与β3亚基细胞质段直接相互作用的黏着斑骨架蛋白中，talin、α-actinin、filamin及tensin这4种蛋白同时具备与整合素和肌动蛋白结合位点[17,18]。其中，talin是目前研究的重点[11,12]。talin是连接整合素αⅡbβ3胞外基质至actin细胞骨架上的关键蛋白，在果蝇实验中，talin IBS2突变可导致肌肉连接缺陷[19]。
静息状态下，talin头部与杆部连接，使其处于自我抑制状态，无法与整合素结合。在激动剂刺激下，talin头部与杆部分离，从而暴露，进一步与β3亚基胞内尾段的NPLY序列结合，导致αⅡb亚基上R995与β3亚基上D723/E726之间的盐桥完全中断，促进整合素αⅡbβ3的激活，使整合素αⅡbβ3处于高亲和状态[20]，此为细胞内向细胞外信号转导。活化的整合素αⅡbβ3与纤维蛋白原结合后，信号由细胞外向细胞内转导，talin杆部的IBS2促进整合素αⅡbβ3与肌动蛋白如actin等结合，形成黏着斑，从而促进整合素αⅡbβ3聚集活化。
Kindlin是另一个重要的信号蛋白，是整合素αⅡbβ3黏附复合体的重要组成部分。其也具有一个球状FERM结构，和talin FERM具有高度的序列一致性[21]，可分成F1、F2、F3 3个亚单位，但kindlin FERM具有一个特征性的结构，即一个pleckstrin同源蛋白(pleckstrin-homology，PH)插入F2亚单位，将其分为2部分。kindlin F3亚单位的分子结构，类似于talin F3亚单位，也具有类似PTB区域的结构，能够识别整合素αⅡbβ3的CT [22]。
在哺乳动物中存在3种kindlin，包括kindlin-1(URP1)，kindlin-2 (Mig2)，kindlin-3(URP2)[23]。kindlin-1主要在上皮细胞表达，可以在皮肤、肠道、肾中发现。kindlin-2在多种组织表达，在骨骼肌、平滑肌细胞表达较高。kindlin-3定位在伪足小体，该位点是整合素αⅡbβ3依赖的黏附位点，主要在血细胞，如白细胞、血小板中表达[24,25]。
Kindlin和talin均为细胞内蛋白，其直接与整合素αⅡbβ3的CT相互作用，并诱导整合素与细胞外配体的高亲和状态。虽然talin可以诱导整合素αⅡbβ3的构象变化，但是已有研究结果表明，单独的talin不足以激活整合素，kindlin在这一过程中也发挥关键作用[26]。kindlin需与talin相互协同才能上调整合素αⅡbβ3与配体的亲和力。研究结果显示，在中华仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell，CHO)中，将靶向kindlin-2的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)(siKind-2)及作为对照的无关RNA分别导入CHO中发现，siKind-2可有效抑制kindlin-2的表达，使其蛋白表达水平下降70%，相应的talin头部介导的整合素αⅡbβ3激活也明显减弱。这提示，采用siRNA降低kindlin表达水平，即使talin相对表达水平高，也不能增加整合素αⅡbβ3的亲和力[27]。
目前，kindlin被认为作为接头蛋白调节蛋白与蛋白的相互作用，从而影响整合素αⅡbβ3的细胞内、外双向信号转导。kindlin通过其PTB结构域与β3远膜端的NITY序列相互作用，协作talin共同调节整合素αⅡbβ3的活性。
G蛋白亚基Gα13被G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors, GPCR)激活，与Rho鸟嘌呤核苷酸交换因子(Rho guanine nucleotide exchange factor，RhoGEF)相互作用，从而激活RhoA，促进血小板的收缩和变圆。干扰Gα13的表达或抑制整合素αⅡbβ3与Gα13的相互作用，可以抑制蛋白激酶c-Src的激活，而此抑制作用可被Rho-kinase抑制剂Y27632逆转。
整合素αⅡbβ3与配体结合可以诱导Gα13与β3细胞质段的E731xE733基序相结合，从而介导细胞外向细胞内信号转导，而且这种结合可以被talin头部排斥干扰。Gα13和talin与β3细胞质内不同位点结合，从而介导不同的信号转导方向，这一信号转换开关的发现为选择性抑制整合素αⅡbβ3细胞外向细胞内信号转导而不干扰细胞内向细胞外信号转导奠定基础[28]。
所有的整合素均具有1个α亚基和1个β亚基，其在氨基酸序列和结构上均具有同源性。整合素αⅡbβ3是血小板聚集所必需的，无论是αⅡb亚基缺陷小鼠[29]，还是β3亚基缺陷小鼠[30]血小板均不能聚集。可见，除整合素αⅡbβ3外的其他血小板受体不能在体内介导血小板聚集，即其本身不足以介导血小板聚集，必须最终经过整合素αⅡbβ3才能达到血小板聚集。由整合素αⅡb或β3异常所导致的αⅡbβ3受体缺失或功能障碍引起的出血综合征称为血小板无力症(Glanzmann′s thrombasthenia，GT)。目前，GT患者根据整合素αⅡbβ3表达水平可分为3种类型：Ⅰ型患者整合素αⅡbβ3表达缺失(<5%)和Ⅱ型表达水平减少(5%~20%)，Ⅲ型虽然其表达正常，但功能缺陷。GT杂合子患者血小板整合素αⅡbβ3表达水平是正常参考值的50%[31]，患者临床无明显出血症状，GT纯合子患者临床表现为严重出血，血小板伸展、黏附等功能缺陷。
整合素αⅡbβ3形成稳定的二聚体，编码整合素αⅡb、β3亚基任一基因缺失均可引起另一亚基不能形成二聚体而被降解，从而导致GT。当β3亚基发生突变时，整合素αⅡbβ3和αvβ3表达均缺陷，而当αⅡb亚基发生突变时，整合素αⅡbβ3表达缺陷，而αvβ3表达几乎无明显变化[28]。目前，我国已报道的GT的10种致病基因突变中，9种为αⅡb亚基突变，1种为β3亚基突变，这可能与αⅡb亚基外显子数量更多相关[32]。
目前，以整合素αⅡbβ3为靶点的抗血栓药物，已经在大多数国家被批准用于临床。临床应用的整合素αⅡbβ3拮抗剂主要包括嵌合单克隆抗体(monoclonal antibody，mAb)抗原结合(fragment of antigen binding，Fab)片段类的阿昔单抗(abciximab)，非肽仿生物类的替罗非班(tirofiban)及合成肽类的依替巴肽(eptifiatide)。
阿昔单抗是一种嵌合mAb Fab，包括鼠单克隆抗体7E3的可变区域、人免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)G1的常变区和轻链κ。其靶点是血小板整合素αⅡbβ3。在体内，阿昔单抗能够有效抑制纤维蛋白原与αⅡbβ3的结合、激动剂诱导的血小板聚集，以及血小板介导的血栓形成[33]。阿昔单抗于1994年被美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准用于临床急性冠脉综合征(acute coronary syndrome，ACS)的治疗。临床试验结果表明，无论是经皮冠状动脉介入治疗的患者，还是对常规治疗无效的不稳定型心绞痛(unstable angina，UA)/非ST段抬高型心肌梗死(non-ST segment elevation myocardial infarction，NSTMI)患者，阿昔单抗均能有效预防缺血性心脏并发症[34]。吴忠荣等[35]纳入108例急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)患者，并将其随机分为研究组(n＝54，低分子肝素抗凝治疗基础上联合应用阿昔单抗)和对照组(n＝54，接受低分子肝素抗凝治疗)，治疗3个月后，研究组患者缺血性心脏病等不良事件的发生率高于对照组，并且差异有统计学意义[31.48%(17/54)比14.81%(8/54)，P<0.05]。对照组出现鼻出血2例、牙龈出血3例，观察组出现鼻出血3例、牙龈出血1例，2组出血事件发生率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。阿昔单抗的血浆半衰期较短，约为30 min，但是作用时间较长，与糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体的结合呈不可逆性，结合后需要较长时间才能被清除，导致血小板功能抑制近48 h，从而增加出血风险[36]。阿昔单抗对整合素αⅡbβ3或αvβ3的拮抗能力几乎相等[37]。此外，阿昔单抗还能与白细胞β2整合素亚家族单位Mac-1(CD11b/CD18，αMβ2)发生反应[38]，这一特点使阿昔单抗具有抗炎和抗细胞增殖的特性，但其临床意义尚不清楚。
阿昔单抗作为一种整合素αⅡbβ3拮抗剂，可有效阻断激活的血小板与纤维蛋白原等结合，从而达到抗血小板聚集的效果，可以有效预防缺血性心肌病，改善心功能，但是具有一定的出血风险，需密切监测。
替罗非班(tirofiban)是一种相对分子量为495的合成化合物，属于酪氨酸衍生物，表现为精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(arginine-glycine-aspartic acid，RGD)模拟物。替罗非班作为整合素αⅡbβ3拮抗剂，可选择性与αⅡbβ3结合，阻断其与纤维蛋白原的结合，从而抑制血小板的聚集。与阿昔单抗相比，替罗非班的优势在于其是一种可逆的拮抗剂，作用时间约为5 min，在不影响血小板计数和血红蛋白(hemoglobin，Hb)值的情况下，不增加症状性出血或血栓栓塞的发生率。文献报道，急性冠状动脉综合征患者接受阿司匹林及肝素治疗后牙龈出血发生率为11.76%(4/34)、皮肤淤斑发生率为8.82%(3/34)，而接受替罗非班治疗后牙龈出血发生率为2.94%(1/34)、皮肤淤斑发生率为0(0/34)[39]。近年，替罗非班被用于ACS患者，作为血管成形术前的桥梁疗法[40]。然而，已有相关研究结果证实，替罗非班可诱导血小板减少症，该反应继发于整合素αⅡbβ3复合反应性药物依赖抗体[41]。这种反应在开始静脉注射替罗非班后数小时内发生，通常在停止输注后消退。在接受替罗非班治疗的6 000例急性冠脉综合征患者中，0.1%~2%患者出现严重的血小板减少[42]。任静等[43]纳入1 102例替罗非班治疗后出现血小板减少患者的研究结果显示，22例患者出现血小板减少症，其中男性为16例，女性为6例；轻度(50×109/L≤血小板计数<100×109/L)血小板减少症为14例(1.27%)，重度(20×109/L≤血小板计数<50×109/L)血小板减少症为4例(0.36%)，极重度(血小板计数<20×109/L)血小板减少症为4例(0.36%)。
替罗非班作为另一种整合素αⅡbβ3拮抗剂，与阿昔单抗相比，是可逆的拮抗剂，相对安全。但替罗非班可致血小板减少，其作用机制暂时尚不明确，可能为药物依赖性抗体所致。药物依赖性抗体通常在接触一种新药的1~2周出现，停药后的1周内相应的症状消失。这可能是由于应用替罗非班后改变血小板上整合素受体的分布，并产生新的抗原，该抗原被血小板上的抗体识别并清除，引起血小板的减少和清除。
依替巴肽(eptifiatide)是一种相对分子量为832的环七肽，基于蛇毒barbourin的结构，具有赖氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(lysine-glycine-aspartic acid，KGD)序列[44]。其是模仿整合素αⅡbβ3拮抗剂barbourin研发获得，对整合素αⅡbβ3具有高特异性和高亲和力。依替巴肽的作用具有剂量依赖性，并与血浆浓度直接相关[45,46]。其血浆半衰期短，为2.5 h，抗血小板作用起效快，停止输注4 h后，血小板抑制作用迅速消失，止血和聚集功能恢复。依替巴肽作为一种辅助抗血栓药物在临床广泛应用，主要用于ST段抬高型心肌梗死(ST segment elevation myocardial infarction，STEMI)患者的首次经皮冠状动脉介入治疗期间。然而，亦有依替巴肽因出血致患者死亡的报道[47,48]。依替巴肽所致出血主要与血小板减少有关，其可以迅速地抑制血小板聚集引起出血，大多数为轻、中度出血，最主要出血部位为经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention，PCI)时的血管穿刺部位、牙龈黏膜等，因极重度血小板减少引起的大出血及颅内出血少见[47,48]。
目前，整合素αⅡbβ3拮抗剂临床推荐静脉给药，也有塞米非班(xemilofiban)，sibrafiban和orbofiban等非肽类口服制剂。这些口服药物可使患者使出血时间延长、血小板减少发生率增加，以及心脑血管疾病死亡率增加。研究结果显示，ACS事件后稳定的患者被随机分配接受阿司匹林、小剂量或者大剂量sibrafiban治疗90 d后，接受阿司匹林治疗患者出现死亡、再发梗死、重度缺血性疾病等的发生率为9.8%(302/3 080)，接受小剂量sibrafiban治疗患者的发生率为10.1%(310/3 070)，接受大剂量sibrafiban治疗患者的发生率为10.1%(303/3 000)[41]。可见，接受sibrafiban治疗患者的大出血发生率高于接受阿司匹林治疗者[49]。由于上述不良反应超过获益，目前暂无口服活性整合素αⅡbβ3拮抗剂获得批准可应用于临床[41]。
整合素αⅡbβ3是一类异源二聚体黏附分子受体，其位于细胞表面，在静止的低亲和力构象和激活的高亲和力构象之间保持着平衡状态。这种平衡对血小板尤其重要。在生理状态下，整合素αⅡbβ3保持其非活化构象，以防止血管内血栓的自发形成。当发生血管损伤时，细胞内蛋白，如talin和kindlin结合至β3细胞质段高度保守的部分，整合素αⅡbβ3激活，迅速从非活化构象转换至活化构象，使其能够结合可溶性配体，如纤维蛋白原和血管性血友病因子等，并启动血小板聚集。
目前临床上常用的新型抗血栓药物作用靶点主要为整合素αⅡbβ3，其均有一定的抗血栓治疗效果，但也存在出血风险，严重者可发生心血管不良事件，甚至是死亡。虽然整合素αⅡbβ3拮抗剂现已广泛应用于预防和治疗血栓。然而，其仍然避免不了出血、血小板减少等不良反应。因此，更好地了解整合素αⅡbβ3信号通路的调控机制，特异性地阻断细胞外向细胞内信号转导，而不影响细胞内向细胞外信号转导，可干扰血栓形成，而减小对止血的影响，对于开发更有效、更安全的抗血栓药物具有重要意义，以期在提高抗血栓疗效的同时，显著减少、减轻或推迟心脑血管疾病和外周血管病变的发生，降低出血风险。
所有作者声明无利益冲突
