再生障碍性贫血(aplastic anemia，AA)发病机制复杂，涉及免疫紊乱、造血干/祖细胞受累和造血微环境异常^[1]。其临床表现主要为贫血、感染和出血。Notch属于跨膜受体蛋白家族，其进化高度保守，由Notch受体(Notch1~4)，Notch配体，如Jagged-1~-2，delta样配体(delta like ligand，DLL)1、3、4，以及CSL DNA结合蛋白3部分组成^[2,3]，通过受体与配体间的相互作用调控各谱系细胞分化。最近的研究结果表明，Notch信号通路在AA的发病机制中发挥重要作用。研究发现，AA小鼠模型分离的脾T细胞中Notch1高表达^[4]。采用遗传学或者药理学方法阻滞Notch1时，小鼠的骨髓有核细胞数量升高，血常规检查指标获得改善，AA小鼠的存活率显著提高(P<0.001)；此外，体外分离的脾T细胞的γ干扰素，肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α水平降低，CD4⁺、CD8⁺ T细胞浸润骨髓比例明显降低(P<0.05)^[4]。此外，Notch信号通路也影响辅助性T细胞(helper T cell，Th)17/调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)平衡。这说明，Notch信号增强参与AA发病，但是也有实验结果证实，Notch信号在间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)调控骨髓免疫抑制中发挥正向作用。Notch信号也参与调控AA骨髓造血干细胞(hematopoietic stem cell，HSC)的自我更新，骨髓微环境中血管生成、促进成骨分化及抑制成脂分化。笔者拟就Notch信号通路对AA患者骨髓微环境、HSC、免疫细胞影响的研究进展进行综述，旨在探讨其在AA发病机制中的作用，以期为靶向Notch信号通路治疗AA提供参考。

Notch受体在结构上可分为Notch胞外区(Notch extracellular domain，NEC)，跨膜区，Notch胞内区(Notch intracellular domain, NICD)。目前，在脊椎动物中共发现4种Notch受体，其中Notch1、Notch2、Notch3在多种组织器官中表达，Notch4则局限表达于成熟巨噬细胞、上皮细胞及胰腺细胞，而造血相关细胞主要表达Notch1及Notch2。Notch受体/配体以直接接触的方式相结合。Notch配体又称DSL蛋白，大部分为I型膜蛋白，其功能区可以和Notch受体结合，从而激活Notch信号通路。CSL DNA结合蛋白，即免疫球蛋白κJ区域重组信号结合蛋白(recombination signal binding protein for immunoglobulin kappa J region，RBPJ)，是一种转录调节因子，存在于细胞核中，参与调节靶基因的转录^[2]。S3裂解位点存在于Notch受体的跨膜区中，信号通路激活后，γ分泌酶对Notch受体进行2次酶切作用，使得其在S3位点发生断裂，NICD游离、活化后进入细胞核，并与DNA结合因子RBPJ和转录共激活因子MAML1~3形成三元复合物，从而调节下游靶基因的表达，调控细胞的增殖和分化。

Notch信号通路的下游靶基因包括c-Myc和Hes-1^[3]。3，5-二氟苯乙酰-L-丙氨酰-S-苯基甘氨酸-t-丁酯(N-[N-(3，5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester, DAPT)为γ分泌酶抑制剂(gamma secretase inhibitor, GSI)，可抑制γ分泌酶的作用，阻止NICD的游离，而阻断Notch信号转导。除经典途径之外，NICD亦参与非经典途径，该途径由雷帕霉素靶蛋白复合体(mechanistic target of rapamycin complex, mTORC)2，AKT，核因子-κB等组成。

在脊椎动物中，HSC来源于胚胎内主动脉-性腺-中肾(aorta-gonad-mesonephros, AGM)区，该过程被称为内皮细胞向造血细胞转化(endothelial to hematopoietic transition, EHT)，而Notch信号通路在EHT中发挥核心作用^[17]。在造血系统中，HSC富含活性NICD，Notch1驱动的细胞周期的调控因子c-Myc表达对HSC的自我更新至关重要^[18]。Chatterjee等^[5]研究发现，AA小鼠模型HSC中Notch1水平下调，c-Myc水平也减少，从而导致c-Myc介导的HSC自我更新能力和存活率降低；AA小鼠模型HSC中Notch1下调还使得Notch1/SOD-2信号通路受到抑制，ROS水平升高，使得HSC DNA甲基化程度降低，细胞凋亡比例增加。在骨髓微环境中，正常HSC的Notch信号通路的作用有待进一步研究。而应用Notch信号通路靶向药物抑制AA患者的免疫功能，需要考虑到其对造血功能的不良影响。

多项研究结果显示，AA患者CD4⁺/CD8⁺ T细胞比例倒置或者降低。IL-2、TNF-α、γ干扰素水平增高，从而抑制骨髓造血功能。此外，CD8⁺ T细胞可抑制骨髓红系集落形成单位(colony forming unit-erythroid, CFU-E)，粒细胞/巨噬细胞集落形成单位(colony forming unit-granulocyte and macrophage, CFU-GM)的生长，从而直接抑制造血功能。活化CD8⁺ T细胞可以转化为终末效应细胞(terminal effector cell, TEC)或者记忆前体细胞(memory precursor cell，MPC)^[24]。Hu等^[25]研究发现，AA患者(n＝45)PBMC和骨髓单个核细胞中效应CD8⁺ T细胞比例显著高于健康个体(n＝30)(P<0.001)。该研究结果提示，CD8⁺ T细胞比例升高可能与AA发病机制中的免疫异常有关。

Notch激活TEC特异性基因表达程序，并抑制MPC的特异性程序。Huang等^[26]研究结果表明，NICD表达可促进TEC的分化，并且敲除Notch1和Notch2或者靶向抑制Notch信号通路的主要转录效应因子RBPJ可干扰Notch信号通路，导致TEC分化减少。Minter等^[21]研究亦发现，与健康个体(n＝6)相比，AA患者(n＝9)的CD8⁺ T细胞群中Notch1表达比例较高(P<0.001)；并且采用GSI处理AA患者的CD8⁺T细胞后，颗粒酶B表达水平明显降低(P<0.01)。上述研究结果表明，Notch信号通路在AA患者CD8⁺ T细胞活化过程中被激活，是产生γ干扰素和颗粒酶B等效应分子的必需信号。此外，Notch是否调控AA患者CD8⁺ T细胞向TEC或者MPC的分化有待进一步探究。

研究结果表明，与健康个体(n＝35)相比，AA患者(n＝85)外周血和骨髓中Th17数量显著增加，且疗效差的患者(n＝51)外周血Th17比例明显高于疗效好者(n＝34)(P<0.05)^[27]。此外，AA患儿(n＝13)接受IST治疗12个月后Th17比例明显低于IST治疗前(P<0.01)^[28]。Th17主要以分泌IL-17为特征，刺激巨噬细胞、中性粒细胞分泌IL-6及TNF-α等促炎因子，与AA发病明显相关。国内、外大量研究结果证实，AA患者骨髓及外周血中缺乏Treg，不能抑制Th1增殖。而且在接受IST治疗后处于恢复期的患者中，可以观察到Treg不同程度的恢复^[28]。但是目前对Notch信号通路调控Th17/Treg扩增与分化的研究结果存在矛盾，需要进一步研究验证。

You等^[29]研究发现，采用可溶性Jagged-1/Fc嵌合蛋白直接激活Jagged-1/Notch信号，可导致IL-6、TGF-β诱导的CD4⁺ T细胞RORγ表达水平明显降低，IL-17表达也明显受到抑制；而采用小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)靶向敲除Hes-1可促进CD4⁺ T细胞表达IL-17。该研究结果表明，Notch1/Hes-1可通过RORγ抑制CD4⁺ T细胞向Th17分化。Wang等^[30]研究亦得到相同结论。Zaman等^[31]研究结果表明，Notch通过促进DC产生视黄醛脱氢酶Aldh1a2，增强TGF-β信号，从而抑制Th17产生，促进Treg分化。Coutaz等^[32]进行的小鼠体内实验结果证实，Notch可负向调节Th17分化。并且在细胞高代谢需求期间，Notch促进Th17细胞因子快速释放，可抵消上述负向调节。该研究更加全面阐明Notch信号通路在Th17分化和功能调节中的作用。

然而，亦有研究结果表明，Notch信号对Th17/Treg的调控可能促进AA的发生、发展。Coutaz等^[32]研究发现，RORγt、IL-17和IL23R启动子是Notch信号的直接靶点。因此，当Notch信号被阻断时，Th17的分化将受到影响。典型的Notch信号介质RBPJ是IL-23R表达的关键驱动因素。Charbonnier等^[33]研究发现，敲除Treg中的Notch1或者RBPJ可增强Treg的调节功能，而促进Treg中NICD的表达可降低其调节免疫的功能，且促进Treg向Th1样效应细胞转化，继而导致自身免疫性疾病的发生。

目前，研究发现，越来越多的血液系统疾病与Notch信号通路的活化存在密切关系，如T细胞白血病、急性髓细胞白血病、霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤等。例如，T细胞白血病细胞中普遍存在Notch信号的活化及Notch靶基因的高表达^[40]。Notch在CD4⁺、CD8⁺ T细胞中均为效应细胞分化的调节因子，在Treg、Th17、DC、巨噬细胞的分化中也发挥重要作用。抑制Notch信号通路对自身免疫系统疾病亦具有治疗前景，如在采用GSI治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)和胶原诱导性关节炎(collagen induced arthritis, CIA)小鼠模型后，疾病均获得改善；中药制剂龙胆泻肝丸及DAPT均可通过抑制Notch信号通路逆转实验性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveoretinitis, EAU)的Th17/Treg失衡^[41,42]。并且有研究结果表明，人工合成的Notch T细胞具有区分不同抗原表达密度靶细胞的能力，能够减少对正常细胞的损害，理论上比常规的嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor-T cell, CAR-T)更具有可控性^[43]。此外，文献报道，干扰Notch4信号可使Treg释放具有免疫抑制功能的外泌体，从而保护动脉免受炎症攻击^[44]。上述研究均为设计靶向Notch信号通路的治疗手段提供了参考。

然而，由于GSI、DAPT的作用并不局限于Notch信号通路，因此开发更具特异性的Notch抑制剂对于AA的精准治疗更具价值。既往直接采用靶向转录因子的小分子抑制剂效果不佳，因此靶向T-bet上游调控因子可能会提供更好的选择。由于不同Notch配体具有不同的免疫调节作用，可构建表达特异性配体的DC，以调节AA患者的免疫功能。由于Notch信号通路在AA患者成脂分化、成骨分化、血管新生、骨髓MSC免疫调节、HSC自我更新及分化中发挥重要作用，而AA患者骨髓微环境中Notch信号通路受损，因此仍需要探究Notch不同配体及下游靶点的不同作用，以期探索新型靶向疗法，改善AA患者的疗效。