白血病是一组高异质性克隆性血液肿瘤，其发病机制尚未完全阐明。人源肿瘤异种移植(PDX)动物模型可以保留肿瘤的异质性、遗传学特征和肿瘤微环境，为研究白血病的分子发病机制和开发新的治疗方法提供工具。笔者拟就白血病PDX动物模型构建的发展历程和PDX动物模型在各类白血病中应用的研究进展进行综述，以期为研究者构建白血病PDX动物模型提供理论和方法依据，使白血病PDX动物模型能够更好地为白血病患者的个体化用药提供指导，为实现白血病精准治疗奠定基础。
版权归中华医学会所有。
未经授权，不得转载、摘编本刊文章，不得使用本刊的版式设计。
除非特别声明，本刊刊出的所有文章不代表中华医学会和本刊编委会的观点。
白血病为常见血液肿瘤，其发病机制的研究和新药筛选一直是相关研究的热点。虽然在白血病发病机制的研究中，体外细胞培养技术已相当成熟，但是即使是复杂的体外细胞培养系统也不能完全模拟体内白血病细胞与骨髓微环境之间复杂的相互作用。由于基因工程小鼠通常仅能引入单基因突变，在发生多基因突变的白血病相关研究中应用受限。因此，为了更好地研究白血病的生物学特征和发病机制，白血病患者来源异种移植(patient-derived xenografts, PDX)动物模型逐渐受到相关研究者的关注。PDX动物模型是指将患者来源的原代肿瘤细胞直接移植至实验动物，使肿瘤细胞在动物机体微环境中生长，其保留了原代细胞、组织的基本特性，为研究肿瘤特征及发病机制提供良好的体内模型[1]。通过建立针对白血病患者的个体化PDX动物模型，对于新药的临床前期筛选和疗效实验，以及实现个体化精准治疗具有重要作用。笔者拟就白血病PDX动物模型的构建及其在各类白血病中应用的研究进展进行综述如下，旨在促进PDX动物模型相关研究结果向临床转化，以期推动白血病的个体化治疗。
小鼠模型一直是研究白血病发病机制的最佳模型之一。20世纪80年代，研究者通过将急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)患者原代白血病细胞皮下移植至免疫缺陷小鼠，成功建立首个AML PDX小鼠模型。此后，PDX模型动物不断扩展，主要包括裸鼠和重度联合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency，SCID)小鼠，非肥胖型糖尿病(non-obese diabetic，NOD)-SCID小鼠及NSG(NOD SCID gamma)小鼠模型，亦包括可弥补小鼠模型局限性的其他模型动物。
早在1982年，Nara等[2]即尝试将白血病患者白血病原代细胞移植至裸鼠体内，但是由于纯合突变裸鼠无胸腺，缺乏功能性T细胞，因此白血病细胞的移植效果差，并且易形成髓外肿瘤。SCID小鼠伴16号染色体PrkdcSCID突变，该基因编码DNA依赖性蛋白激酶的催化亚基，参与T、B细胞的T细胞抗原受体(T cell receptor，TCR)，B细胞抗原受体(B cell receptor，BCR)基因的V(D)J重排。因此，SCID小鼠缺乏功能成熟的T、B细胞，但是保留了自然杀伤(natural killer，NK)细胞功能[2]。与仅伴T细胞缺乏的裸鼠相比，SCID小鼠免疫缺陷程度更高，在成瘤所需肿瘤细胞接种量及成瘤速率方面均更具优势[3]。此外，通过将PrkdcSCID突变引入不同遗传背景的小鼠品系中，可以获得遗传特征多样的SCID小鼠。
为了进一步提高异种肿瘤细胞植入率，研究者将SCID与NOD小鼠进行品系杂交，建立免疫缺陷程度更高的NOD-SCID小鼠。NOD-SCID小鼠缺乏功能性B或者T细胞，NK细胞和巨噬细胞活性低。NOD-SCID小鼠即使仅注射少量白血病原代细胞，其肿瘤细胞植入率也较SCID小鼠更高。此外，大部分异种移植白血病细胞在PDX NOD-SCID小鼠模型体内扩增后，仍保留了细胞原有形态、表型和遗传特征[4]。NOD-SCID小鼠独有的多种特异性免疫缺陷为人造血功能重建提供了良好的系统，是人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)-1基因治疗研究的重要模型，同时可用于评估肿瘤细胞增殖、侵袭及转移的潜力，以及抗肿瘤治疗的疗效。
NSG小鼠是通过NOD-SCID小鼠与白细胞介素2受体γ链(interleukin 2 receptor gamma chain，IL-2Rγ)－/－小鼠杂交产生，表现为T、B、NK细胞功能性缺失，是异种移植、免疫重建小鼠模型的重要载体。IL2rg基因缺失可导致小鼠免疫系统几乎完全缺失，从而有利于白血病细胞的植入。NSG小鼠是目前最常用于血液肿瘤研究的PDX模型动物[5]。与NOD-SCID小鼠相比，NSG小鼠中人体细胞和组织移植存活率显著提高，同时能够植入更高比例的人正常或肿瘤细胞和组织[3]。此外，NSG小鼠能够满足作为人类免疫系统疾病模型动物的需求，植入人造血干细胞(hematopoietic stem cell，HSC)后，NSG小鼠模型的外周淋巴组织可以产生人T细胞。
虽然小鼠模型一直是主要PDX动物模型，但是该哺乳动物模型仍存在一些问题有待解决，如成瘤时间长，无法实施活体成像，无法实现高通量的药物筛选和分析。而PDX斑马鱼模型可以有效解决上述问题。斑马鱼的基因和蛋白与人类存在70%~80%的相似性。转基因等技术的发展使斑马鱼模型成为一种重要的药物测试动物模型之一，可用于白血病细胞的功能分析、基因操作和实时成像，成为研究白血病的动物模型[6]，可应用于人类疾病模型研究、新药筛选、药物安全性评价。
移植方式对肿瘤细胞的摄取率、浸润率、模型动物的总体生存期和对测试药物的敏感度均有不同程度的影响。目前，构建PDX动物模型的移植方式主要包括：①皮下接种。皮下接种是目前最常见的异位移植方式。该方法是将患者白血病细胞植入4~12周龄小鼠背侧皮下，操作简便，且不影响小鼠的正常活动，但是仅能在局部成瘤，不能模拟白血病患者体内的真实情况[7]。②尾静脉或者股骨内注射。尾静脉或者股骨内注射是目前白血病最常用的PDX动物模型尾静脉或者股骨内注射移植方式。研究者将分离自患者骨髓的白血病细胞去除T细胞后通过尾静脉或者股骨内注射至8~14周龄的小鼠中，获得的小鼠模型可以更好地模拟白血病患者的自然疾病进展。因此，尾静脉或者股骨内注射移植比皮下接种更具有移植优势，但是同时也需要多方面的监测手段观察小鼠是否移植成功，且该移植方法耗时且成本高[8,9]。
为了更好地研究白血病的发病机制和寻找更有效的治疗药物。目前已有多项研究利用多种不同的载体工具修饰、优化PDX动物模型，其中基因编辑和修饰及荧光标记在白血病PDX动物模型载体修饰中较为常用。
为了更好地利用PDX动物模型进行相关基因及蛋白的功能研究，目前多项研究致力于PDX动物模型的基因编辑与修饰。规律成簇的间隔短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)/CRISPR相关蛋白(CRISPR associated protein, Cas)9基因编辑是探索及验证蛋白功能的可靠工具。Liu等[10]采用CRISPR/Cas9基因编辑成功构建了PDX动物模型。该PDX动物模型，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除目标基因，并克隆17个相关基因靶序列，对患者来源白血病细胞进行慢病毒转导，从而减少患者来源白血病原代细胞在PDX动物模型中的增殖，最终PDX动物模型中经基因编辑的白血病细胞富集比例高达80%。Liu等[11]应用CRISPR/Cas9基因编辑的PDX动物模型进行研究发现，敲除类固醇受体共激活剂(steroid receptor coactivator，SRC)家族酪氨酸激酶LYN后，可增加急性B淋巴细胞白血病(acute B-lymphocyte leukemia，B-ALL)的PDX动物模型对长春新碱的反应，提示LYN在B-ALL中发挥促进肿瘤发生、发展的作用。同时，Liu等[11]利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，构建稳定敲除kruppel样因子(kruppel-like factor，KLF)4基因的B-ALL PDX动物模型，随后应用浓度为2.5 μmol/L阿扎胞苷处理B-ALL PDX动物模型和敲除KLF4基因的B-ALL PDX动物模型，48 h后采用流式细胞术(flow cytometry, FCM)检测PDX动物模型中白血病细胞活力发现，与处理前相比，前者的细胞活力降低，而后者细胞活力无降低(P<0.01)。该研究结果表明，阿扎胞苷通过上调KLF4表达水平发挥其抗肿瘤作用。PDX动物模型的基因工程改造可以验证相关基因功能，亦有助于寻找肿瘤中适宜治疗靶点，并将其靶向治疗功能与临床可用药物联系起来，最终实现白血病患者的个体化治疗。
目前体内成像技术对PDX动物模型中的疾病监测具有重要作用。多个研究团队已经成功将生物发光成像(bioluminescence imaging，BLI)引入白血病PDX动物模型中，应用方法包括细胞分选和慢病毒转导细胞。研究结果表明，在白血病PDX动物模型中，与外周血监测相比，BLI应用于疾病监测更为敏感[12]。药物疗效实验结果亦表明，与外周血监测相比，BLI在监测治疗反应方面具有更高的敏感度[12]。Jones等[12]构建ALL PDX小鼠模型时，利用AKR1C3慢病毒转导患者来源的ALL细胞，并接种至NSG小鼠中进行扩增，以稳定表达荧光素酶，通过BLI和外周血监测评估ALL PDX小鼠模型对长春新碱、地塞米松和L-门冬酰胺酶诱导方案的反应。结果显示，与外周血监测相比，BLI监测显示出较大的检测范围和较高的敏感度。该研究结果证实，与外周血监测相比，BLI监测可显著加快和增强对白血病负荷的检测。因此，BLI可以实现对白血病的早期监测，敏感度高，并且可以定量确定治疗期间微小残留病(minimal residual disease，MRD)的部位。总之，基于BLI监测的ALL PDX动物模型可用于更加精准的白血病MRD检查，同时可显著提高新药临床前评估的预测能力，从而有助于可靠预测新药的临床疗效，以确保疗效优良的药物进入临床试验阶段。
与实体瘤PDX动物模型建立后的评价、监测相比，白血病PDX动物模型的评价监测指标更多，也更复杂。传统的白血病PDX动物模型评价指标包括FCM免疫表型、外周血原始细胞数量、HSC增殖指标、二代测序(next generation sequencing, NGS)等。目前也有多个研究团队在此基础上，建立了多种创新型白血病PDX动物模型评价体系。
目前，FCM被广泛用于白血病PDX小鼠模型中白血病细胞的免疫表型监测。相关研究者通常认为，白血病患者细胞的免疫表型在白血病细胞异种移植后稳定表达[13]。然而，在部分免疫表型复杂的B-ALL患者中，白血病相关免疫表型通常不稳定。在诊断时，B-ALL患者通常表现出多种细胞表面抗原的异质性表达[14]，并在化疗和疾病进展期间表现出不可预测的免疫表型变化[15]。Rolf等[16]开发了一种新型FCM平台，可检测PDX动物模型中白血病细胞相关免疫表型的变化，因此可以扩展PDX动物模型在复发白血病治疗方面的研究，如通过该平台及时监测MRD，若监测到早期复发，可予患者免疫靶向治疗。总之，FCM免疫表型检测技术可进行白血病细胞复杂免疫表型变化的监测，且检测灵敏度高，极大地扩展PDX动物模型在研究白血病进展和评估复发白血病细胞亚群靶向治疗方面的应用。
虽然HSC增殖研究的实验方案已经建立并广泛应用，但是其不太适用于体内环境，并且相关时间序列数据的分析通常复杂。为了克服上述限制，Vlachou等[17]提出荧光标记AML PDX动物模型的详细方案，即ProCell框架，以在单HSC水平上利用PDX动物模型的方法，监测并研究体内HSC增殖动力学。ProCell框架能够根据FCM检测数据对HSC增殖进行详细和准确的模拟。此外，ProCell框架能够推断各种HSC亚群(包括静息HSC)的比例和HSC周期。因此，通过HSC增殖指标可以了解白血病PDX动物模型中伴不同基因突变的HSC可能导致特定基因克隆的优势增殖。此外，白血病细胞克隆和单个HSC内的不同增殖动力学可以解释化疗后观察到的白血病演变过程。
通过NGS了解体细胞突变的情况有助于白血病的诊断和患者预后评估，同时也可以指导治疗。在白血病PDX动物模型建立过程中，传统基因测序无法检测到复杂变异。Barwe等[18]通过NGS方法，对白血病PDX小鼠模型进行研究，以确定与白血病患者来源原代细胞的相关体细胞突变是否一致。结果显示，患者来源的原代细胞和PDX小鼠模型的白血病细胞在单核苷酸变异和基因融合之间具有高度一致性，而其他复杂结构变异则不完全一致。与患者来源原始样本相比，在PDX小鼠模型白血病细胞多次传代中，主要驱动突变的基因融合仍稳定存在。这证实，NGS具有追踪患者来源原始样本和PDX小鼠模型白血病细胞中的复杂基因变异的能力，从而对于确保该模型可用于白血病发病机制及治疗研究至关重要。总之，NGS技术为分析复杂基因组变异和识别与白血病相关细胞突变提供了一种灵敏而应用性强的方法。
目前，治疗方案的不断优化延长了白血病患者的生存期，但仍存在复发/难治性白血病患者对传统化疗耐药的情况。因此，建立相应的PDX动物模型，可为患者筛选出新的治疗方案，为临床治疗提供参考。
针对AML的临床前研究需要适宜的动物模型，以提高对其分子发病机制的理解，进而开发新的、靶向性高的治疗方法。Kempf等[19]将伴zeste2增强子(enhancer of zeste，EZH)2基因功能缺失突变第1、2次复发AML患者白血病细胞连续移植至NSG小鼠体内，分别建立PDX-AML-491(第1次复发AML患者白血病PDX动物模型)和PDX-AML-661(第2次复发AML患者白血病PDX动物模型)，采用阿糖胞苷和柔红霉素联合处理PDX小鼠模型，并在80 d内监测小鼠模型白血病负荷。结果显示，PDX-AML-491小鼠模型的白血病细胞数量急剧下降，75%的小鼠被完全治愈，而PDX-AML-661小鼠几乎对治疗无反应。对AML患者和PDX小鼠模型中68个复发相关突变基因靶向测序结果显示，PDX-AML-661小鼠模型中伴EZH2突变的克隆显著增加。该研究结果证实，EZH2功能缺失突变的AML PDX小鼠模型对阿糖胞苷耐药。尽管将AML细胞异种移植至免疫缺陷小鼠模型中是扩展和研究人类AML发病机制极具价值的工具，但其无法解决白血病细胞与免疫系统不同细胞的相互作用，导致被移植的AML细胞通常会发展为其他自发性恶性肿瘤。为了克服这些限制，相关研究者利用生物工程和合成材料开发领域的新进展，制造生物插入支架[20]。这些支架的功能是在小鼠体内创造人源化微环境，在不改变其特征和功能的情况下，有效支持异种移植细胞的扩增和分化。在NOD-SCID小鼠中，使用涂有新鲜分离的人骨髓间充质干细胞的聚氨酯支架成功地实现了原代AML细胞移植[21]。上述这些新方法为克服小鼠和人类骨髓微环境之间的差异及AML样本内部异质性发挥了重要作用，可进一步拓展PDX动物模型在AML研究中的应用。
急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)是起源于单个B或T前体细胞的恶性肿瘤，其复发率高。因此，能够重现人ALL生物学特征的实验动物模型是探索靶向新疗法的关键工具。目前，原代人ALL PDX小鼠模型作为临床前模型备受关注。Lopez-Millan等[7]将混合谱系白血病(mixed-lineage leukemia，MLL)重排呈阳性的B-ALL患者骨髓分离的白血病细胞通过静脉注射至8~14周龄的NGS小鼠中，通过分析外周血监测白血病细胞移植成功与否，FCM检测异种移植B-ALL细胞免疫表型，最终成功建立ALL PDX小鼠模型，为探讨伴MLL重排B-ALL治疗靶点提供了临床前PDX动物模型。Tasian等[22]将10种具有不同Ph样基因改变的ALL患者白血病细胞通过静脉注射至NSG小鼠体内，采用磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)抑制剂处理2~4周，与空白载体处理的对照小鼠相比，所有经PI3K处理的小鼠模型外周血和脾中白血病细胞增殖均被抑制(P<0.05)。该研究结果证实，PI3K/mTOR抑制剂能够有效降低体内肿瘤负荷。目前，嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell，CAR-T)免疫疗法在ALL中发展迅速。相关研究者利用PDX小鼠模型对CAR-T免疫疗法进行研究，使得PDX动物模型成为更有价值的临床前研究模型。为避免CAR-T和T-ALL细胞之间靶抗原相同而导致CAR-T损伤，Sánchez-Martínez等[23]提出，由于CD1a的表达主要局限于发育中的皮质胸腺细胞，在个体发育过程中，CD34+祖细胞和T细胞均不表达CD1a，从而可降低CAR-T免疫疗法不良反应的发生风险。该研究团队将表达CD1a的皮质T淋巴细胞白血病(cortical acute T lymphocyte leukemia，coT-ALL)患者来源的原始细胞静脉注射至6~12周的NSG小鼠中，3 d后再静脉输注(1.5~5.0)×106 CD1a CAR-T，从而构建携带CD1a CAR-T的T-ALL PDX动物模型。利用该模型研究结果证实，CD1a CAR-T可特异性杀伤CD1a+ coT-ALL细胞。CD1a CAR-T除在体外具有特异性细胞毒性，在体内也具有抗白血病活性。可见，PDX动物模型在ALL相关研究中具有重要作用。
慢性髓细胞白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)是一种以髓细胞增生为主的HSC恶性克隆性疾病。9号染色体上的Abelson白血病病毒(Abelson leukemia virus，ABL)基因与22号染色体上的断裂点簇集区(breakpoint cluster region，BCR)基因融合形成的BCR-ABL融合基因，其为CML致病的分子学基础。针对BCR-ABL融合基因酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor，TKI)的出现，为CML的治疗带来重要进展。尽管TKI可靶向治疗CML，但是患者耐药发生率高，通过PDX动物模型进行CML新药的筛选和疾病复发预测可为耐药CML患者带来新的希望。Kinstrie等[24]研究发现，CML白血病干细胞的生存并非完全依赖于BCR-ABL融合蛋白活性，其他潜在的免疫标志物可能提示TKI停药后分子复发风险高的患者。研究者通过定量逆转录-PCR证实，与健康个体骨髓样本相比，CD93基因在CML患者中CD34+外周血细胞和骨髓细胞中表达水平上调(P<0.000 1)。随着CD34+细胞向单核细胞分化成熟，CD93表达水平显著下降(P<0.000 1)。这表明，CD93高表达可能是CML原始白血病干细胞的特异性标志。随后，研究者将慢性期CML患者CD34+ CD93+和CD34+ CD93－ 2细胞亚群通过尾静脉注射至亚致死剂量照射(200 cGy)8~12周龄NSG小鼠体内建立了CML PDX小鼠模型，然后通过FCM分选出CD93+和CD93－白血病干细胞。通过细胞周期实验结果证实，与CD93－白血病干细胞比较，CD93+白血病干细胞的存活和自我更新能力更强(P<0.01)。这提示，CD93在白血病干细胞上选择性表达，并且与CML细胞亚群的自我更新相关，可能成为CML高风险复发预测分子标记。可见，PDX动物模型是CML复发预测的良好动物模型。尽管TKI时代，CML患者预后已获得显著改善，但仍存在TKI耐药患者，相关研究者利用PDX动物模型，进行高通量新药筛选已成为相关研究热点。
慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)是一种以CD5呈阳性成熟小B细胞在外周血、骨髓、淋巴结及脾过度聚集为特征的血液肿瘤。Manna等[25]采用FCM分选22例CD38+ CLL患者外周血单个核细胞，注射至NSG小鼠，建立CLL PDX小鼠模型。研究结果显示，与空白对照处理的小鼠相比，采用CD38靶向抑制剂处理CLL PDX小鼠模型的程序性死亡因子(programmed death factor, PD)1+细胞毒性T细胞比例显著降低(P＝0.03)。该PDX动物模型实验结果表明，靶向CD38在CLL中可以调节肿瘤的微环境，从而促进免疫重建以增强抗CLL效应。Vaisitti等[26]研究结果显示，采用IT-901(新型选择性核因子-κB抑制剂)处理CLL PDX小鼠模型，可以有效阻断核因子-κB转录，显著降低肿瘤负荷。与空白对照组相比，IT-901治疗显著减少了小鼠肝、脾及骨髓中肿瘤细胞的数量(P<0.05)；同时，与注射IT-901的6例小鼠相比，注射空白对照治疗的6例小鼠的中位存活时间显著缩短(43 d比31 d，P<0.05)。可见，CLL PDX小鼠模型可应用于验证多种新靶向疗法的疗效，但是PDX小鼠属于免疫缺陷小鼠，无法评估免疫相关治疗方法在CLL中的应用，尤其CLL本身也存在B细胞的免疫缺陷，这在一定程度上限制了CLL PDX动物模型的应用。
PDX动物模型已被广泛应用于白血病研究中，为疾病的发病机制和药物筛选提供了有价值的研究工具。但是目前仍存在局限性，如即使花费大量的时间和经济成本，建模的成功率仍不能得到保证。其次，建模后疾病的监测指标复杂，无法全面准确了解疾病的发生、发展。虽然目前常用检测指标包括FCM免疫分型、NGS等，但是研究者难以兼顾所有指标。随着白血病相关研究的进展，MRD等问题仍然棘手。PDX小鼠模型无法评估免疫相关治疗方法在免疫缺陷疾病中的应用。尽管存在上述局限，NGS等相关技术的快速发展仍在不断促进更高效精准动物模型的产生，为了解白血病的分子发病机制，识别具有预后预测价值的遗传标志，并开发新的治疗策略提供依据。
所有作者声明无利益冲突
