黄连素抗小鼠幽门螺杆菌感染作用的研究

胡晨旻

doi:10.3760/cma.j.issn.1673-4912.2019.04.010

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中国小儿急救医学

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黄连素抗小鼠幽门螺杆菌感染作用的研究

作者及单位信息

出版日期： 2019 -04 -20 ·

DOI： 10.3760/cma.j.issn.1673-4912.2019.04.010

Study on the anti-Helicobacter pylori infection effects of berberine in mice

Authors Info & Affiliations

Hu Chenmin

Pediatrics Department, Affiliated Hangzhou First People′s Hospital, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou, 310006, China

Published： 2019 -04 -20 ·

DOI： 10.3760/cma.j.issn.1673-4912.2019.04.010

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摘要

目的观察黄连素协助治疗小鼠幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)感染的效果。

方法建立Hp感染小鼠模型，按不同抗Hp治疗方案分为3组：标准三联组给予抗Hp标准三联治疗方案(阿莫西林＋克拉霉素＋奥美拉唑)，黄连素组在标准三联疗法基础上加用黄连素，铋剂组在标准三联疗法基础上加用胶体果胶铋。连续给药2周，停药4周后采用胃黏膜Giemsa染色法、快速尿素酶试验检测Hp根除情况。通过体外继代培养Hp，采用琼脂稀释法进行体外抗生素敏感试验，检测黄连素对Hp的最低抑菌浓度。

结果标准三联组、黄连素组、铋剂组Hp根除率分别为55.0%(22/40)、77.5%(31/40)、95.0%(38/40)，黄连素组根除率低于铋剂组，高于标准三联组，差异有统计学意义( P<0.05)。体外实验黄连素对Hp标准菌株最低抑菌浓度为12.5mg/ml。

结论黄连素对Hp有一定的抑菌能力，黄连素联合标准三联疗法，可以提高Hp根除率。

关键词：幽门螺杆菌;黄连素;最低抑菌浓度;阿莫西林;克拉霉素

ABSTRACT

ObjectiveTo observe the anti-Helicobacter pylori(Hp) infection effects of berberine in mice.

MethodsA young rats model of Hp infection was established, then the rats were divided into 3 groups according to different anti-Hp treatments.The standard group was given a standard triple therapy(amoxilin+ clasamycin+ omeprazole), the berberine group was added with berberine on the basis of the standard triple therapy; and the bismuth group was added with bismuth on the basis of the standard triple therapy.All the three groups received continuous treatment for 2 weeks.The eradication condition of Hp was detected by gastric mucosa Giemsa staining and rapid urinary enzyme test 4 weeks after discontinuation.In addition, the minimum antibacterial concentration of berberine was detected by using agar dilution method antibiotic sensitivity test through Hp culturing in vitro.

ResultsThe Hp eradication rate of standard triplet group, berberine group and bismuth group was 55.0%, 77.5% and 95.0%, repectively, the difference was statistically significant( P<0.05). The eradication rate of berberine group was higher than that of standard triplet group, but lower than that of bismuth group( P<0.05). Meanwhile, the minimum antibacterial concentration of berberine was 12.5 mg/ml in vitro.

ConclusionBerberine has antibacterial ability against Hp, which combined with standard triple therapy can improve the eradication rate of Hp.

KEYWORDS： Helicobacter pylori;Berberine;Minimum antibacterial concentration;Amoxilin;Clasamycin

Corresponding author: Huchenmin, Email: mocdef.qabq272332851

FUNDING:

Project of Nanjing Medical University（2016NJMU153）

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引用本文

胡晨旻. 黄连素抗小鼠幽门螺杆菌感染作用的研究[J]. 中国小儿急救医学,2019,26(4)：284-287.

DOI:10.3760/cma.j.issn.1673-4912.2019.04.010

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幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是革兰阴性、微需氧细菌，生存于胃部、十二指肠的各区域内，它会引起胃黏膜炎症，与消化性溃疡、胃癌有密切的关系，是最常见的传染性病原菌之一 ^{[
1
]}。但由于抗生素的大量应用，使之耐药率逐年递增。中药中有对HP有杀菌/抑菌作用的药物，黄连素是其中研究较常见的有效成分 ^{[
2
]}。本研究通过在体动物实验研究黄连素抗Hp的作用，体外实验探讨黄连素对Hp的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)。

1　对象与方法

1.1　研究对象

SPF级4周龄Balb/c小鼠共200只，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK(沪)2012-0002，合格证号：0303494。饲养环境：温度范围20～25 ℃，相对湿度范围40%～70%。

1.2　药品与试剂

盐酸小檗碱(国药准字H11020962，批号170309，北京中新药业股份有限公司)；阿莫西林胶囊(国药准字H20003263，批号7100013，珠海联邦制药股份有限公司中山分公司)；克拉霉素片[国药准字H10970156，批号277002，重庆科瑞制药(集团)有限公司]；奥美拉唑肠溶胶囊(国药准字H19991118，浙江金华康恩贝生物制药有限公司)；胶体果胶铋胶囊(国药准字H10920072，山西安特生物制药股份有限公司)。

1.3　方法与分组

在140只小鼠中随机选取10只作为正常对照，予每只小鼠生理盐水0.5 ml灌胃，每隔2 d 1次，共7次。其余130只小鼠制造Hp感染模型，予每只小鼠Hp液1×10 ⁹CFUs，0.5 ml菌液灌胃，每隔2 d一次，共7次，之后随机挑选10只小鼠与正常对照小鼠一同处死，进行快速尿素酶试验和Giemsa染色电镜观察，检测是否存在Hp感染。确认造模成功后将Hp感染的其余120只小鼠采用随机数字表法分为3组，每组40只。标准三联组：予标准三联疗法治疗2周[阿莫西林：50 mg/(kg·d)，2.4 ml，分2次；克拉霉素：15 mg/(kg·d)，4.8 ml，分2次；奥美拉唑0.8 mg/(kg·d)，2.0 ml分2次)]；黄连素组：在标准三联疗法基础上加用黄连素治疗2周[黄连素7.5 mg/(kg·d)，2.1 ml；阿莫西林：50 mg/(kg·d)，2.4 ml，分2次；克拉霉素：15 mg/(kg·d)，4.8 ml，分2次；奥美拉唑0.8 mg/(kg·d)，2.0 ml分2次]；铋剂组：在标准三联疗法基础上加用铋剂治疗2周[胶体果胶铋8 mg/(kg·d)，1.8 ml；阿莫西林：50 mg/(kg·d)，2.4 ml，分2次；克拉霉素：15 mg/(kg·d)，4.8 ml，分2次；奥美拉唑0.8 mg/(kg·d)，2.0 ml分2次]。3组小鼠在停药4周后统一处死。

1.4　标本采集与检测

各组小鼠禁食不禁水5 h，处死解剖取出胃，沿胃大弯和胃小弯剪开，一半固定后Giemsa染色电镜观察，一半4 ℃保存送微生物室进行快速尿素酶试验。Hp检测：(1)快速尿素酶法检测：使用Hp快速尿素酶检测试剂盒，取胃黏膜组织1块放在黄色试纸中央，1～3 min内观察试纸颜色变化，试纸组织边缘1 min内由黄色变成樱红色为强阳性，3 min内变成樱红色为弱阳性，不变色为阴性；(2)胃黏膜Giemsa染色法：将胃组织切片浸入Giemsa染液中常温染色2 min，自来水洗1 min，将切片浸入1%醋酸溶液分化数秒，自来水洗，镜检染色结果：Hp感染呈淡蓝色。

1.5　体外黄连素抗Hp抑菌能力检测

琼脂稀释法 ^{[
3
]}：将黄连素用蒸馏水稀释，高压灭菌，稀释的不同浓度的黄连素按1∶9比例加入到已融化后冷却到50 ℃左右的M-H琼脂中，并加入哥伦比亚培养基，使培养基和黄连素混合后制成125 mg/ml、100 mg/ml、75 mg/ml、50 mg/ml、37.5 mg/ml、25 mg/ml、12.5 mg/ml、5 mg/ml、2.5 mg/ml等不同递减浓度的平板。取菌株接种于培养基，校正其浓度相当于0.5麦氏比浊标准调整适当的浓度，微量加样器吸取1 μl接种于琼脂平板表面，后置于35 ℃下孵育48～72 h，观察结果。琼脂表面如见到轻微细菌生长，对比不同平板以抑制90%以上细菌生长的最低药物浓度作为最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)。

1.6　统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行统计分析，计数资料用百分率表示，组间率的比较采用Pearson卡方检验， P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　小鼠Hp感染情况检测

通过快速尿素酶试验和Giemsa染色电镜观察检测正常对照和造模小鼠Hp感染情况，结果显示造模的10只小鼠快速尿素酶试验和Giemsa染色均为阳性，正常对照10只小鼠均为阴性。造模小鼠胃黏膜Giemsa染色电镜下观察，可见胃黏膜小凹处淡蓝色Hp生长，证实成功建立Hp感染小鼠模型( 图1 )。

图1 电镜下小鼠胃黏膜Giemsa染色幽门螺杆菌感染情况

A：对照组正常胃黏膜；B：模型组胃窦黏膜Giemsa染色(×100)显示小凹内淡蓝色区域为幽门螺杆菌；C：模型组胃黏膜高倍镜(×1 000)下可见淡蓝色的幽门螺杆菌生长。

2.2　不同治疗方法Hp根除率比较

根除率＝(初始Hp阳性数－停药4周后依然Hp阳性数)/初始Hp阳性数×100%。为确保实验准确性，分别采用两种检测方法进行Hp感染检测，快速尿素酶法和Giemsa染色法，其阳性结果一致。标准三联组根除率为55.0%(22/40)，黄连素组根除率为77.5%(31/40)，铋剂组根除率为95.0%(38/40)，3组根除率差异有统计学意义( P<0.05)，其中黄连素组根除率低于铋剂组( χ ²＝5.165， P＝0.024)，高于标准三联组( χ ²＝4.528， P＝0.029)，组间差异有统计学意义( P<0.05)。见表1 。

分组	鼠数(只)	根除率(%)	幽门螺杆菌检测阳性(只)
分组	鼠数(只)	根除率(%)	快速尿素酶法	Giemsa染色法
标准三联组	40	55.0	18	18
黄连素组	40	77.5	9	9
铋剂组	40	95.0	2	2
χ ²值		17.552
P值		<0.001

表1各组幽门螺杆菌根除率比较

2.3　黄连素对Hp的体外抑制作用

通过琼脂稀释法进行黄连素抗Hp体外抑菌实验：Hp在哥伦比亚血平板35 ℃微需氧，恒温培养箱中培养3 d，可见琼脂平板上大量Hp生长，活菌数N＝8.2×10 ⁹ CFU/ml；黄连素稀释后与培养基混合，菌株接种35 ℃下孵育72 h，可见琼脂平板仅有微量细菌生长，抑制率90%以上，见图2 。不同浓度黄连素对Hp有抑制作用，MIC为12.5 mg/ml。

图2 光镜下琼脂平板上幽门螺杆菌生长情况(×40)

A：琼脂平板上可见大量幽门螺杆菌生长；B：黄连素处理后琼脂平板仅有微量幽门螺杆菌生长，抑制90%以上。

3　讨论

目前，Hp感染已被证实与人体胃、十二指肠疾病有着非常密切的关系 ^{[
4
]}，甚至是慢性胃炎、十二指肠球部溃疡的直接致病因素，也发现其在胃黏膜相关样淋巴组织淋巴瘤(MALT淋巴瘤)、胃癌的发生发展演变过程中扮演重要的角色 ^{[
5
]}。有数据显示，成人Hp感染率已超过50% ^{[
6
]}，而少年儿童作为HP易感人群，其感染率也在逐年增长。研究发现，我国儿童HP的感染以每年1%～4%比例增长，尤其是12岁以上的儿童感染率已超过40%，而且临床中也表现出来不同的症状 ^{[
7
]}。因此在临床治疗中，根除Hp的意义毋庸置疑。而根除Hp的方案在不断的临床实践中得到更新，目前质子泵抑制剂＋多种抗生素联合为根除Hp感染的主要治疗方案，儿童中标准三联疗法(质子泵抑制剂＋克拉霉素＋阿莫西林)是目前国内推荐的根除Hp治疗的一线方案 ^{[
8
]}，常用抗生素为阿莫西林、甲硝唑、克拉霉素。但由于抗生素的大量使用，导致HP的耐药性不断增强，根除率一直在下降。特别是Hp对质子泵抑制剂＋克拉霉素＋阿莫西林的耐药性，更是不断增强，有大样本研究发现，在西方发达国家以及北美、日韩等国家和地区，该方案的根除率已经低于80%，而我国的Hp根除率甚至更低，仅55%～78% ^{[
9
]}。Hp对甲硝唑、克拉霉素、阿莫西林、左氧氟沙星等耐药情况不容乐观，分别高达59.3%～95.0%、2.7%～47.8%、4%～54.3%、22.1%～33.1% ^{[
10
]}，这给临床带来很大的挑战。《第五次全国Hp感染处理共识报告》 ^{[
11
]}均推荐在成人中把含铋剂的四联疗法作为克拉霉素高耐药区的一线治疗方案，推荐疗程为10～14 d。儿童根除治疗不利因素较多，包括抗菌素选择余地小(仅推荐阿莫西林、克拉霉素和甲硝唑)和对药物不良反应耐受性低 ^{[
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]}，铋剂对儿童的不良反应较大，目前不推荐作为一线方案 ^{[
13
]}。儿童作为特殊人群，其Hp治疗面临更大的挑战，如何寻找耐药率低，不良反应小，又能获益更大，疗效确切的药物迫在眉睫。因此，研究新的根除Hp的方案有着重要意义，筛选新的抗菌药物已经成为该领域的研究热点。而我们的目光聚焦到了祖国医学，中医中药博大精深，中药在感染性疾病中的应用有着悠久的历史，在中药中寻找新的有效的抗Hp药物不失为一策略。

国内已有研究发现，一些清热解毒的中药包括黄连、黄芩、大黄、板蓝根、五味子、乌梅等药物，对Hp具有较强的抑制作用 ^{[
14
]}。黄连素是其中的中药有效成分，亦称小檗碱，是从黄连、黄柏等提取而来，多年来用于抗菌消炎，特别是肠道、胆道感染等 ^{[
15
]}。已有临床研究表明黄连素有一定的抗Hp作用 ^{[
16
]}，临床研究发现，黄连素联合三联杀菌方案能有效治疗顽固性胃炎患者，并起到杀菌作用 ^{[
17
]}，而在老年慢性萎缩性胃炎患者中，黄连素亦有一定疗效 ^{[
18
]}。黄连素联合三联疗法治疗Hp阳性消化性溃疡的疗效也得到临床验证 ^{[
19
]}。

但在儿童中的临床研究鲜有报道，本研究通过小鼠造模，给予黄连素干预后，与标准三联和含铋剂的四联方案进行比较，结果发现，标准三联杀菌方案的总根除率为55.0%，黄连素联合标准三联杀菌方案Hp根除率为77.5%，含铋剂四联杀菌方案Hp根除率95.0%( P<0.05)。差异有统计学意义，标准三联方案基础上加入黄连素后可增加小鼠感染Hp的根除率，虽较含铋剂组略低，但也证实黄连素有一定的协同抗菌作用，能增加根除率。为了证明黄连素的这一作用，我们又设计了体外抑菌实验来验证这一结果，通过琼脂稀释法来测定黄连素在Hp标准菌株中的抑菌效力，结果显示黄连素单药对Hp有抑菌效力，其MIC为12.5mg/ml，该结果与董凤 ^{[
20
]}的研究结果一致。这一结果证实了黄连素的抗Hp作用。也有学者做了机制分析，认为其可能机制为抑制Hp细胞内对葡萄糖的氧化反应，从而使病菌无法得到充足的营养而凋亡 ^{[
21
]}，但具体分子生物学机制有待进一步实验研究。

黄连素抗Hp作用在小鼠实验得到验证，为其在儿科临床应用上提供新的思路和方向，对揭示中药作用机制，实现中药现代化具有重要意义。该研究为临床研究提供了理论基础，在儿童体内以及在不同性别、年龄段、地区等是否仍有较好的抗菌效果，以及对耐药菌株的作用效力，与其他抗生素相比是否存在优越性等，均需后续进一步开展实验和临床研究。

摘要
1　对象与方法
2　结果
3　讨论
参考文献

参考文献

[1]

Di Giulio M , Di Campli E , Di Bartolomeo S ,et al. In vitro antimicrobial susceptibility of Helicobacter pylori to nine antibiotics currently used in Central Italy[J]．Scand J Gastroenterol,2016,51(3):263-269. DOI： 10.3109/00365521.2015.1092577 .