2019冠状病毒病病原体分离与鉴定

刘延刚; 任浩; 戚中田

doi:10.3760/cma.j.issn.1673-4211.2020.0001

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国际生物制品学杂志

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2019冠状病毒病病原体分离与鉴定

作者及单位信息

出版日期： 2020 -02 -19 ·

DOI： 10.3760/cma.j.issn.1673-4211.2020.0001

Isolation and identification of etiological agent of 2019 coronavirus disease

Authors Info & Affiliations

Liu Yangang

Department of Biomedical Defense, PLA Key Laboratory of Biodetection and Biodefense, Shanghai Key Laboratory of Medical Biodefense, Naval Medical University, Shanghai 200433, China

Ren Hao

Qi Zhongtian

Published： 2020 -02 -19 ·

DOI： 10.3760/cma.j.issn.1673-4211.2020.0001

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摘要

重症急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）是新近分离鉴定的第七种可以感染人类的冠状病毒，已确认为目前正在暴发流行的2019冠状病毒病（coronavirus disease 2019，COVID-19）的病原体。SARS-CoV-2可在COVID-19患者的支气管肺泡灌洗液、鼻咽拭子、血液等样本中检出，细胞分离培养相对容易。鉴于病毒培养分离和病原学鉴定对病毒复制增殖、致病免疫、检测诊断和特异防治等都具有重要意义，此文就SARS-CoV-2分离、病原学鉴定以及根据宏基因组测序的反向病原学研究现状与进展做一综述。

关键词：重症急性呼吸综合征冠状病毒2;2019冠状病毒病;宏基因组测序;病毒分离;鉴定

ABSTRACT

Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) is a newly isolated and identified coronavirus, the seventh that can infect humans. The SARS-CoV-2 has been confirmed to be the etiological pathogen of coronavirus disease 2019 (COVID-19) currently in epidemic outbreak. SARS-CoV-2 can be isolated relatively easily from the bronchoalveolar lavage fluid, nasopharyngeal swabs and blood specimens of confirmed COVID-19 patients. Given the great significance of viral isolation and etiological identification for viral replication, pathogenicity, immunity, diagnosis, as well as specific prevention and control, this article reviews the status and progress of SARS-CoV-2 in isolation and etiological identification, especially in metagenome next-generation sequencing-based reverse etiology.

KEYWORDS： Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2;Coronavirus disease 2019;Metagenome next-generation sequencing;Viral isolation;Identification

Corresponding author: Qi Zhongtian, Email: nc.defudabe.ummstziq

FUNDING:

National Science and Technology Major Project for Infectious Diseases Control（2017ZX10304403-003）

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引用本文

刘延刚,任浩,戚中田. 2019冠状病毒病病原体分离与鉴定[J]. 国际生物制品学杂志,2020,43(00)：E001-E001.

DOI:10.3760/cma.j.issn.1673-4211.2020.0001

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2003年SARS和2012年中东呼吸综合征（Middle East respiratory syndrome，MERS）的全球性疫情暴发^{[
1
]}，使冠状病毒（coronavirus，CoV）受到越来越多的关注。2019年12月开始，武汉市暴发重症急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）感染引起的2019冠状病毒病（coronavirus disease 2019，COVID-19）疫情，并迅速波及全国及世界，被WHO列为国际关注的突发公共卫生事件。采用病毒分离培养和宏基因组测序（metagenome next-generation sequencing，mNGS）迅速分离和鉴定引起疫情暴发的病原体并获得全基因组序列，对疫情防控起到了关键作用。海军军医大学全军生物侦检与防护重点实验室承担COVID-19疑似病例核酸检测任务，同时关注着SARS-CoV-2分离与病原学鉴定进展，现综述如下。

1　SARS-CoV-2

1.1　CoV

CoV为单股正链RNA病毒，基因组全长约30 kb，由5’-端非编码区、非结构蛋白ORF1a/b编码区、4种主要结构蛋白编码区以及3’-端非编码区组成^{[
2
]}。结构蛋白编码区主要编码刺突蛋白（spike protein，S）、包膜蛋白（envelope protein，E）、膜蛋白（membrane protein，M）和核衣壳蛋白（nucleocapsid protein，N）^{[
3
]}。一般认为野生动物如蝙蝠是CoV的天然宿主，蝙蝠携带的CoV可以通过中间宿主跨物种感染人类^{[
4
]}。此前已发现6种CoV可以引起人类疾病，其中4种（HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43和HCoV-HKU1）可引起普通感冒样症状^{[
5
]}，另外2种（SARS-CoV和MERS-CoV）感染后病情较重，可引起重度肺炎、呼吸困难，病死率较高^{[
6
]}。2003年SARS疫情暴发，造成全球29个国家和地区8 096例感染，其中774例死亡^{[
7
]}。2012年6月，沙特阿拉伯暴发MERS疫情，随后传及亚洲、非洲、欧洲和美洲的多个国家和地区^{[
8
]}。据WHO报告，截至2019年11月底，MERS在27个国家和地区共有2 494确诊病例，858人死亡，病死率34.4%^{[
9
]}。

1.2　SARS-CoV-2

2019年12月始，武汉市相继出现不明原因肺炎病例，流行病学分析显示这些病例多与武汉华南海鲜批发市场暴露有关^{[
10
]}。患者主要表现为发热、咳嗽、呼吸急促，影像学检查呈肺炎改变，部分患者发展为急性呼吸窘迫综合征，可在短时间内恶化并死于多器官功能衰竭^{[
11
]}。研究人员利用mNGS获得该病毒全基因组序列，基因序列比对分析表明该病毒为一种新的CoV^{[
12
]}，随后被国际病毒分类委员会命名为SARS-CoV-2。SARS-CoV-2自然宿主是蝙蝠^{[
12
,
13
]}，中间宿主尚不明确。截至2020年2月16日24时，全国累计报告COVID-19确诊病例70 635例，治愈10 853例，死亡1 772例。

2　病毒分离与鉴定

2.1　临床标本采集

采集COVID-19患者鼻（咽）拭子、支气管肺泡灌洗液、血液、痰液或粪便等标本^{[
14
]}，低温（2~8 ℃）无菌保存，安全运送，用于核酸、抗原检测或细胞分离培养。其中支气管肺泡灌洗液样本的病毒含量高、活性好，最适合进行病毒分离培养^{[
12
,
15
,
16
,
17
]}。

2.2　病毒分离培养

以支气管肺泡灌洗液为例，离心去除细胞碎片，取上清液接种于培养状态良好并用PBS洗3遍的人呼吸道上皮细胞（human airway epithelial cell，HAE），细胞密度25万/孔，37 ℃孵育2 h后弃去培养基，PBS洗去未与细胞结合的病毒。每48小时加150 μl PBS，37 °C孵育10 min后，收集细胞顶端面样品，1∶3稀释传代到新的细胞中。光学显微镜下每天观察细胞病变，并用实时荧光定量PCR（real-time PCR，RT-PCR）检测上清液中的病毒核酸。经过3次传代后，高速离心收集上清液中病毒用于测序^{[
12
,
17
]}，并将细胞制成超薄切片用透射电镜观察病毒形态。此外，Zhou等^{[
16
]}用Vero细胞和Huh7细胞也成功分离了患者肺泡灌洗液中的SARS-CoV-2，并观察到明显的细胞病变，Lu等^{[
17
]}从咽拭子样本中也分离出SARS-CoV-2。

2.3　病原学鉴定

对细胞培养分离的SARS-CoV-2，采用核酸检测、抗原检测、电镜检查以及mNGS等方法进行鉴定。

2.3.1　核酸检测

核酸检测是目前SARS-CoV-2鉴定和COVID-19患者确诊的重要方法。在获得病毒全基因组序列后，多项研究设计了靶向SARS-CoV-2的特异引物和对应的荧光探针（染料法不需要探针，具体序列见表1 ），通过RT-PCR检测样本中SARS-CoV-2。截至2020年1月31日，国家药品监督管理局已经应急审批通过7家企业的7个SARS-CoV-2核酸检测试剂盒（RT-PCR法）产品。

基因	引物(5’-3’)	探针
orf1ab	F: AGAAGATTGGTTAGATGATGATAGT	FAM-TCCTCACTGCCGTCTTGTTGACCA-BHQ1
orf1ab	R: TTCCATCTCTAATTGAGGTTGAACC
orf1ab	F: CCCTGTGGGTTTTACACTTAA	FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1
orf1ab	R: ACGATTGTGCATCAGCTGA
N	F: GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT	FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA
N	R: CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG
S	F: CCTACTAAATTAAATGATCTCTGCTTTACT	-
S	R: CAAGCTATAACGCAGCCTGTA	-
S	F: CAATGGTTTAACAGGCACAGG	-
S	R: CTCAAGTGTCTGTGGATCACG	-
RdRp^a	F: GTGARATGGTCATGTGTGGCGG	FAM-CAGGTGGAACCTCATCAGGAGATGC-BBQ
RdRp^a	R: CARATGTTAAASACACTATTAGCATA
E^a	F: ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT	FAM-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-BBQ
E^a	R: ATATTGCAGCAGTACGCACACA

表1检测SARS-CoV-2扩增引物和探针序列^{[
12
,
16
,
17
,
18
,
19
]}

注：orf1ab：开放阅读框1ab; N：核衣壳蛋白；S：刺突蛋白；RdRp：RNA依赖RNA聚合酶；E：包膜蛋白；F：正向；R：反向；FAM：荧光素；-：无；^a针对RdRp和E基因的引物和探针由Corman等^{[
19
]}在2019新型冠状病毒序列确定前设计并测试

2.3.2　抗原检测

鉴于蝙蝠SARSr-CoV Rp3与SARS-CoV-2的N蛋白具有92%的氨基酸一致性，Zhou等^{[
16
]}利用抗SARSr-CoV Rp3 N抗体，采用间接免疫荧光法检测到Vero E6细胞培养中的SARS-CoV-2。作者利用重组该蛋白检测COVID-19患者的血清抗SARS-CoV-2 N抗体，7例患者中5例IgG抗体强阳性，3例IgM抗体阳性。

2.3.3　透射电镜观察

分离培养的病毒感染细胞或上清液可用于透射电镜观察，负染色的SARS-CoV-2粒子通常为球形并具有一定的多形性，直径60~140 nm，表面呈日冕样并有明显刺突（长9~12 nm），细胞质膜结合囊泡中可观察到充满病毒颗粒的包涵体，见图1 ^{[
12
]}。

图1 分离培养重症急性呼吸综合征冠状病毒2的透射电镜图片^{[
12
]} 　A　培养上清液　B　感染的呼吸道上皮细胞

2.3.4　mNGS与反向病原学鉴定

mNGS在SARS-CoV-2基因组测序、溯源分析和反向病原学鉴定中发挥了关键作用^{[
12
,
15
,
16
,
17
,
18
,
20
,
21
]}。以支气管肺泡灌洗液或细胞培养物上清液中的病毒RNA为模板，除去宿主核酸，进行cDNA合成用于文库建库，联合Illumina和Nanopore测序平台进行基因组测序，使用CLC Bio生物信息学软件进行片段组装，设计特异引物用于PCR并使用5'-和3'-cDNA末端的快速扩增（RACE）获得全基因组序列^{[
12
]}。全基因组序列比较和系统树分析有助于明确SARS-CoV-2与其他病毒的亲缘关系（图2 ），推测病毒来源、人群传播方式和是否发生重组等^{[
17
]}。

图2 重症急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CovV-2）基因组信息分析^{[
12
]} 　A　SARS-CoV-2基因结构　B　与其他β冠状病毒基因组的系统发育分析

注：UTR：非编码区；NSP：非结构蛋白；Spike：刺突蛋白；E：包膜蛋白；M：膜蛋白；N：核衣壳蛋白；Enzyme：酶切位点；Receptor binding：受体结合位点；MERS-CoV：中东呼吸综合征冠状病毒

3　小结与展望

mNGS在SARS-CoV-2鉴定中发挥了不可替代的作用，而由mNGS提供的基因组信息在COVID-19病原体确认中又起到了关键作用，这些都得益于反向病原学研究的进展。传统病原学鉴定是先鉴定出病原体，然后确定该病原体与疾病的关系，而近年来提出的反向病原学，则是先进行mNGS找出病原体基因组序列，然后由基因组序列反推出病原体。飞速发展的mNGS技术与生物信息学和病原体基因组学结合，已经成为发现和鉴定病原体的新途径^{[
22
]}，此次mNGS技术在SARS-CoV-2发现和COVID-19确认中的应用，为未来公共卫生突发事件应对和传染病防控提供了有益借鉴，具有深远意义。

摘要
1　SARS-CoV-2
2　病毒分离与鉴定
3　小结与展望
参考文献

参考文献

[1]

Chan JF , Lau SK , To KK ,et al. Middle East respiratory syndrome coronavirus: another zoonotic betacoronavirus causing SARS-like disease[J]. Clin Microbiol Rev, 2015,28(2):465-522. doi: 10.1128/CMR.00102-14 .