眼表β属冠状病毒受体的研究进展

尹小磊; 张金萍

doi:10.3760/cma.j.cn115989-20200223-00098

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中华实验眼科杂志

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眼表β属冠状病毒受体的研究进展

作者及单位信息

出版日期： 2020 -03 -10 ·

DOI： 10.3760/cma.j.cn115989-20200223-00098

Advance in research of beta coronavirus receptors on ocular surface

Authors Info & Affiliations

Yin Xiaolei

Department of Ophthalmology, 305 Hospital of PLA, Beijing 100017, China

Zhang Jinping

Novel Coronavirus Research Group in 305 Hospital of PLA, Beijing 100017, China

Published： 2020 -03 -10 ·

DOI： 10.3760/cma.j.cn115989-20200223-00098

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摘要

造成我国自2019年12月份开始的全国性新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的病因是新型冠状病毒(2019-nCoV)感染。2019-nCoV是目前已知所分4个属冠状病毒科的β属冠状病毒。对人类影响较大的β属冠状病毒，除2019-nCoV外，还有严重急性呼吸道综合症冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)。2019-nCoV的受体也是SARS-CoV的受体血管紧张素转换酶2(ACE2)，MERS-CoV的受体是二肽基肽酶4(DPP4，或CD26)。免疫组织化学检测发现，ACE2在人类眼表的角膜和结膜上皮细胞、角膜内皮细胞均呈阳性表达，DPP4在正常动物眼结膜上皮细胞及其下方结缔组织的成纤维细胞中活性较强，在严重角膜损伤后整个角膜上皮和泪液中活性较强。两种受体均参与多个信号通路和多种病理生理过程，它们在眼表的表达是冠状病毒眼部感染可能的途径，为进一步研究冠状病毒眼部致病机制提供了线索。

关键词：冠状病毒;受体;血管紧张素转换酶2;二肽基肽酶4;眼表

ABSTRACT

2019-Novel coronavirus (2019-nCoV) caused an outbreak of corona virus disease 2019 (COVID-19) from December 2019 in China.2019-nCoV which was identified as a kind of beta coronavirus belongs to one of four coronavirus genera.Except 2019-nCoV, two other beta coronavirus, severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) and Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) are also quite harmful to human beings.2019-nCoV uses the same cell entry receptor, angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2), as SARS-CoV.And dipeptidyl peptidase 4 (DPP4) or CD26 is the cell receptor for MERS-CoV.The expression of ACE2 was found to have obvious positive expression in human corneal and conjunctival epithelium, and corneal endothelium.DPP4 activity was presented in normal animal conjunctival epithelium and fibroblasts of the subjacent connective tissue.It was also presented in the whole corneal epithelium and tear fluid of animal with severe injured corneas.The two receptors, ACE2 and DPP4, are involved in many cellular signaling pathways and pathophysiological processes.Their expression in the cells of ocular surface may be an access route of corona virus in eye, which provides clues to elucidating the pathogenesis of corona virus in the eyeballs.

KEYWORDS： Coronavirus;Receptor;Angiotensin-converting enzyme 2;Dipeptidyl peptidase 4;Ocular surface

Corresponding author: Zhang Jinping, Email: mocdef.3ab61122179ieloaixniy

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引用本文

尹小磊,张金萍. 眼表β属冠状病毒受体的研究进展[J]. 中华实验眼科杂志,2020,38(03)：254-256.

DOI:10.3760/cma.j.cn115989-20200223-00098

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2020年2月11日，国际病毒分类委员会正式将近期发现的新型冠状病毒(2019 novel coronavirus，2019-nCoV)命名为2型严重急性呼吸道综合症冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)，同日世界卫生组织将新型冠状病毒肺炎命名为2019新型冠状病毒感染疾病(corona virus disease-19，COVID-19) ^{[
1
]}。2019-nCoV造成了我国自2019年12月份开始的全国性COVID-19疫情 ^{[
2
]}。国家卫生健康委员会于2020年2月18日发布的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第六版)》指出，新型冠状病毒肺炎的主要传播途径是经呼吸道飞沫和密切接触传播，在相对封闭的环境中长时间暴露于高浓度气溶胶情况下存在经气溶胶传播的可能。眼表的黏膜经泪道与呼吸道黏膜物理相连，角膜、结膜由外胚层和中胚层发育形成，呼吸道黏膜也是由外胚层发育而来，COVID-19有可能造成暴露的眼球感染或传播。本文对眼表冠状病毒受体的研究进展进行综述。

1　冠状病毒的分类及特性

1937年，Beaudet和Hudson第一次从小鸡体内分离到了冠状病毒。随后几十年，人们在对这些病毒进行形态学研究时通过电子显微镜发现，这些病毒的包膜上有类似日冕棘突的形状，结合且形态表现，1975年世界病毒命名委员会正式将其命名冠状病毒科。根据其基因组结构及系统发生学分析，冠状病毒科可分为4个属，分别是α属冠状病毒(alpha coronavirus，α-CoV)、β属冠状病毒(beta coronavirus，β-CoV)、γ属冠状病毒(gamma coronavirus，γ-CoV)、δ属冠状病毒(delta coronavirus，δ-CoV)。对人类造成影响的冠状病毒主要有7种：人冠状病毒229E(human coronavirus 229E，HCoV-229E)、人冠状病毒HKU1(human coronavirus HKU1，HCoV-HKU1)、人冠状病毒NL63(human coronavirus NL63，HCoV-NL63)、人冠状病毒OC43(human coronavirus OC43，HCoV-OC43)、严重急性呼吸道综合症冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV)、中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)以及2019-nCoV ^{[
3
]}。前4种冠状病毒，仅在免疫低下者中引起一般性呼吸道感染，或在婴儿及老年人中引起严重的呼吸道感染。SARS-CoV和MERS-CoV致病性较强，曾大规模暴发，在感染者中病死率较高 ^{[
4
]}，COVID-19与SARS一样，被纳入《中华人民共和国传染病防治法》规定的乙类传染病，按甲类传染病管理。

冠状病毒有4种结构蛋白，刺突蛋白(spike protein，S蛋白)、膜蛋白、包膜蛋白和核衣壳蛋白。病毒成功入侵感染宿主细胞，主要依赖于S蛋白。S蛋白是三聚体糖蛋白，为Ⅰ类融合蛋白，可被宿主的furin蛋白酶裂解为S1与S2两条多肽，S1多肽与宿主受体结合，S2多肽主要介导病毒包膜与细胞膜的融合过程 ^{[
5
]}，病毒不同S蛋白所含氨基酸不同。2019-nCoV和SARS-CoV相比所含氨基酸明显不同，例如，尽管它们与血管紧张素转换酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)结合的受体结合模体(receptor-binding motif，RBM)氨基酸一致，但在受体结合区(receptor-binding domain，RBD)的其他区域就有6个氨基酸不同。这些差异是否影响它们对宿主的趋向性和传染性，尚有待于更多科研工作的开展来揭秘 ^{[
6
]}。

2　眼表β属冠状病毒受体

SARS-CoV、MERS-CoV和2019-nCoV，是3种致病性比较强的β属冠状病毒。病毒学研究结果表明，SARS-CoV的受体是ACE2 ^{[
7
]}，MERS-CoV的受体为二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase 4，DPP4，或CD26) ^{[
8
]}。我国学者目前已证实2019-nCoV也可通过结合ACE2感染宿主细胞 ^{[
9
]}，但是否还存在其他受体尚不清楚。

2.1　ACE2受体

ACE2属于M2蛋白酶家族，为Ⅰ型膜结合糖蛋白，是一种含锌离子的单羧基肽糖蛋白酶，由805个氨基酸组成，可分为4个部分，由17个氨基酸组成的信号肽胞外段N端，构成羧基肽酶活性中心的结构域，疏水跨膜区和一个由42个氨基酸组成的胞内段C端。ACE2仅有一个酶活性位点，即N端结构域的7个糖基化位点，对维持酶的活性和结构稳定至关重要 ^{[
10
]}。

2019-nCoV和SARS-CoV两种冠状病毒与ACE2受体的结合，既有相似点又有不同点。它们都通过S蛋白的S1多肽上受体结合区(receptor-binding domain，RBD)与ACE2结合。最新的结构研究表明，2019-nCoV有扭曲的4个反向平行的β片层(β1、β2、β3和β6)和短连接螺旋与环形成核心区。在β3和β6之间，有一个扩展插入，包含β4和β5短链、α4和α5螺旋、以及环 ^{[
11
]}。这个扩展插入就是受体结合模体(receptor-binding motif，RBM)，其包含了大多数与ACE2结合的2019-nCoV氨基酸残基结合点。ACE2的N末端肽酶结构域有两个凸起，在它们之间形成肽底物结合部位。2019-nCoV的RBD中扩展的RBM与ACE2小凸起底侧结合，RBM的外表面有一个凹陷以容纳ACE2的N末端螺旋。2019-nCoV的RBD和SARS-CoV RBD总体结构相似，均方根偏差最小值为1.2 Å，两者的RBM虽有较多的序列差异，总体结构仍旧高度相似，均方根偏差最小值为1.3 Å，两者的不同只是在末端有一个明显的构象变化。2019-nCoV的RBD与ACE2的结合模式和SARS-CoV RBD与ACE2的结合模式非常相似。RBM外表面将ACE2的N末端螺旋卷起，使得RBD和ACE2之间的接触面非常大，冠状病毒与ACE2受体的亲和力也就很强。以4Å的距离为界，2019-nCoV RBD有18个氨基酸残基和ACE2的20个残基相结合，而SARS-CoV RBD有16个残基和ACE2的20个残基相结合。ACE2与两种不同RBD相互作用的20个残基中有17个是共享的，且多数位于N末端螺旋。两种RBD与ACE2相互作用的14个共享氨基酸位中，8个有相同的残基，有5个位置的残基尽管侧链不同但生化特性相似，两种RBD只是表面静电势有所不同。两种病毒具有的RBD的相近结构能够解释它们与ACE2受体的亲和力范围相同，约10－60 nM。但也有报道称2019-nCoV S蛋白与ACE2的亲和力是SARS-CoV RBD-SD1与ACE2亲和力的10～20倍，这可能与在研究中使用不同的蛋白有关 ^{[
12
]}。

迄今为止，ACE2眼表分布情况尚未检索到有国外学者的报道。国内学者柳林等 ^{[
13
]}的研究结果表明，ACE2在人类眼表的角膜和结膜上皮细胞、角膜内皮细胞呈阳性表达，角膜的成纤维细胞有弱阳性表达。角膜和结膜上皮细胞、结膜成纤维细胞的细胞质中也有明显的阳性表达，但在细胞膜的表达弱于细胞质。关于ACE2在眼表的分布和表达相关研究文献极少，当前的这些研究结果是否也适用于其他物种如兔、鼠等，以及不同的种属间是否会存在差异目前均不明了，有待于进一步深入研究。

ACE2还大量表达于人类肺和小肠的上皮细胞，在口腔、鼻黏膜、鼻黏部、胃、小肠、结肠、肝脏、肾脏、脾脏、脑、骨髓、皮肤、淋巴结等也有阳性表达 ^{[
14
]}。ACE2通过作用ACE1和ACE2这两个底物参与肾素－血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)生理活动 ^{[
15
]}，而RAS对水盐代谢、维持血压稳定以及心血管、泌尿、生殖等系统的发育和功能调节，甚至是炎症反应、损伤修复、愈合及造血等病理生理过程都发挥重要作用 ^{[
16
]}。

2.2　DPP4受体

DPP4属于丝氨酸蛋白酶家族，是一种多功能Ⅱ型跨膜糖蛋白，常以同源二聚体的形式存在，含有766个氨基酸，包含胞质尾、跨膜部分和胞外部分3个区域。胞外部分由两部分组成，即三联体Ser630-Asp708-His740组成的催化区域和N端八叶型β-螺旋区域及C端α/β-水解酶区域，催化位点位于两个胞外区域之间的空腔内，这部分是化合物的活性结合位点 ^{[
17
]}。

研究发现，MERS-CoV RBD包含一个核心结构域和一个受体结合结构域。核心结构域是5个反向平行的β片层(β1、β2、β3、β4和β9)与在连接环中的2个短α螺旋，3个二硫键维持核心结构域的折叠结构。受体结合结构域是4个反向平行的β片层(β5、β6、β7和β8)，位于核心结构域的β4和β9之间。β6和β7有一个连接环与β片层垂直交叉，该环通过二硫键与β5相连，为β片层与DPP4结合提供了结构基础。DPP4的N端β-螺旋区域有八叶，MERS-CoV RBD与4叶和5叶相结合。在3.6 Å的距离内，MERS-CoV的14个残基和DDP4的15个残基相结合 ^{[
18
]}。

关于DPP4在眼表组织中的分布目前主要是一些哺乳动物的研究结果。Cejková等 ^{[
19
]}发现在猪和牛的角膜的上皮细胞及内皮细胞中均未检测DPP4活性，但在一些角膜上皮细胞下的组织中可检测到微弱的DPP4活性，而结膜上皮细胞及其下方结缔组织的成纤维细胞中DPP4活性较强。Stodůlka等 ^{[
20
]}发现正常兔角膜检测不到DPP4的活性，但LASIK术后可在角膜中检测到。Cejková等 ^{[
21
]}也发现正常兔角膜中检测不到DPP4的活性，只在泪液中有少许活性，而严重角膜损伤后整个角膜上皮和泪液中DPP4的活性较强。

除了眼表组织外，DPP4在哺乳动物肾、肝、小肠、胰腺上皮细胞和血管内皮细胞、淋巴细胞以及细菌和植物中等均有表达 ^{[
17
,

22
]}，通过其水解作用及参与腺苷酸活化蛋白激酶、Toll样受体4、丝裂原活化蛋白激酶、蛋白酪氨酸激酶信号转导和转录活化子、蛋白激酶B、蛋白激酶C等多种信号通路而影响细胞的各种病理生理过程，与营养代谢性疾病、自身免疫性疾病、炎症性疾病、肿瘤等疾病的发生和发展密切相关 ^{[
22
,

23
,

24
]}。

呼吸道病毒能够侵犯眼部，眼表两种β属冠状病毒受体的分布使得眼部作为2019-nCoV的传播途径成为可能，且两种受体蛋白都在淋巴系统有表达，结膜淋巴管也可能是感染的途径。由于两种受体蛋白的功能及作用的多样性，2019-nCoV通过眼部发病的作用机制会比较复杂，目前要阐明其中的机制对眼科相关专业科研人员仍然是一个巨大的挑战。

摘要
1　冠状病毒的分类及特性
2　眼表β属冠状病毒受体
参考文献

参考文献

[1]

Gorbalenya AE . Severe acute respiratory syndrome-related coronaviru-The species and its viruses, a statement of the Coronavirus Study Group[J]. BioRxiv,2020.02.07. DOI： 10.1101/2020.02.07.937862 .