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中国小儿急救医学
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ENGLISH ABSTRACT
脓毒症患儿外周血中ATPase相关基因及关联长链非编码RNA的差异表达
王圆圆
卢秀秀
陈源美
李宁
李伟
孙中媛
郭琳瑛
崔小岱
宋国维
张琪
作者及单位信息
·
DOI： 10.3760/cma.j.issn.1673-4912.2020.04.008
The differential expression of ATPase-related genes and associated long non-coding RNAs in peripheral blood of children with sepsis
Wang Yuanyuan
Lu Xiuxiu
Chen Yuanmei
Li Ning
Li Wei
Sun Zhongyuan
Guo Linying
Cui Xiaodai
Song Guowei
Zhang Qi
Authors Info & Affiliations
Wang Yuanyuan
Department of Critical Care Medicine, Capital Institute of Pediatrics-Peking University Teaching Hospital, Beijing 100020, China
Lu Xiuxiu
Department of Critical Care Medicine, Capital Institute of Pediatrics-Peking University Teaching Hospital, Beijing 100020, China
Chen Yuanmei
Department of Pediatrics, Peking University China-Japan Friendship School of Clinical Medicine, Beijing 100029, China
Li Ning
Department of Critical Care Medicine, Capital Institute of Pediatrics-Peking University Teaching Hospital, Beijing 100020, China
Li Wei
Department of Critical Care Medicine, Capital Institute of Pediatrics-Peking University Teaching Hospital, Beijing 100020, China
Sun Zhongyuan
Department of Critical Care Medicine, Capital Institute of Pediatrics-Peking University Teaching Hospital, Beijing 100020, China
Guo Linying
Department of Critical Care Medicine, Capital Institute of Pediatrics-Peking University Teaching Hospital, Beijing 100020, China
Cui Xiaodai
Central Laboratory, Capital Institute of Pediatrics, Beijing 100020, China
Song Guowei
Department of Critical Care Medicine, Capital Institute of Pediatrics-Peking University Teaching Hospital, Beijing 100020, China
Zhang Qi
Department of Pediatrics, Peking University China-Japan Friendship School of Clinical Medicine, Beijing 100029, China
·
DOI： 10.3760/cma.j.issn.1673-4912.2020.04.008
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摘要

目的筛选和验证脓毒症患儿外周血中差异表达的长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNAs)，探讨其在儿童脓毒症发病机制中的作用。

方法选取2016年1月至12月在首都儿科研究所附属儿童医院ICU进行救治的3例脓毒症患儿和3例健康儿童的外周血标本，通过lncRNA测序技术筛选出差异表达的lncRNAs和mRNAs；对差异表达的lncRNAs进行靶基因预测，并根据GO分析结果选出与线粒体ATP合酶(F 1F O-ATPase)活性相关的lncRNA-mRNA关系对；进一步扩大样本量，采用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(qRT-PCR)技术对筛选结果中F 1F O-ATPase活性相关的部分mRNAs及lncRNAs进行验证。

结果测序结果显示，与健康儿童相比，脓毒症患儿外周血中差异表达的lncRNAs共252个(86个表达上调，166个表达下调)，差异表达的mRNAs共2 652个(955个表达上调，1 697个表达下调)；qRT-PCR验证结果显示：lncRNA ENST00000621933.1、ENST00000616950.1、ENST00000595748.1在脓毒症患儿中表达升高( P<0.05)，MT-ATP8、ATP5E以及lncRNA ENST00000624705.1和ENST00000615535.1在脓毒症患儿中表达降低( P<0.05)，与测序结果一致。

结论脓毒症患儿外周血中存在差异表达的lncRNAs，以MT-ATP8及ATP5E作为靶基因的lncRNA ENST00000621933.1、ENST00000616950.1、ENST00000595748.1、ENST00000624705.1和ENST00000615535.1的表达水平可能与儿童脓毒症的发生发展有关。

脓毒症;长链非编码RNA;线粒体ATP合酶;儿童
ABSTRACT

ObjectiveTo screen and identify differentially expressed long non-coding RNA (lncRNAs) in peripheral blood of children with sepsis, and to explore the role of lncRNAs in the pathogenesis of sepsis in children.

MethodsThe peripheral blood samples of 3 children with sepsis admitted to the ICU of Children′s Hospital of Capital Institute of Pediatrics from January to December 2016 and 3 healthy children who underwent physical examination in our hospital during the same period were selected, and the differential expression profiles of lncRNAs and mRNAs were screened by lncRNAs sequencing technology.The target genes of differentially expressed lncRNAs were predicted and the relationship pairs of lncRNA-mRNA related to F 1F O-ATPase activity were constructed according to the results of GO analysis.Further increasing the sample size, we verified the expression of some F 1F O-ATPase activity-related mRNAs and lncRNAs which were differentially expressed in the screening results by real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction(qRT-PCR).

ResultsSequencing results showed that there were 252 lncRNAs with significant differential expression in peripheral blood of children with sepsis compared with healthy children, of which 86 were up-regulated and 166 were down-regulated; meanwhile, there were 2 652 mRNAs with significant differential expression, of which 955 were up-regulated and 1 697 were down-regulated.The results of qRT-PCR showed that the expression of lncRNA ENST00000621933.1, ENST00000616950.1 and ENST00000595748.1 in peripheral blood of children with sepsis increased( P<0.05), while the expression of MT-ATP8, ATP5E and ENST00000624705.1, ENST00000615535.1 in peripheral blood of children with sepsis decreased( P<0.05), which was consistent with the sequencing results.

ConclusionlncRNAs are differentially expressed in peripheral blood of children with sepsis compared with healthy children.The expression levels of lncRNA ENST00000621933.1, ENST00000616950.1, ENST00000595748.1, ENST00000624705.1 and ENST00000615535.1 which their target genes are MT-ATP8 and ATP5E may be related to the development of sepsis in children.

Sepsis;Long non-coding RNA;F 1F O-ATPase ;Children
Zhang Qi, Email: mocdef.aabnis5530iqgnahz
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引用本文

王圆圆,卢秀秀,陈源美,等. 脓毒症患儿外周血中ATPase相关基因及关联长链非编码RNA的差异表达[J]. 中国小儿急救医学,2020,27(04)：272-278.

DOI:10.3760/cma.j.issn.1673-4912.2020.04.008

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脓毒症被定义为由于机体对感染的反应失调所引起的危及生命的器官功能障碍 [ 1 ]，是导致重症监护病房(ICU)中患儿死亡的主要原因之一。虽然近年来对脓毒症的治疗手段不断丰富和规范，但是由于其发生机制复杂，缺乏特异性的治疗手段，其病死率仍然居高不下 [ 2 ]。越来越多的研究表明，线粒体功能障碍在脓毒症病理生理机制中发挥关键作用 [ 3 , 4 ]。而线粒体ATP合酶(F 1F O-ATPase)缺陷是导致线粒体能量代谢障碍的重要原因之一。
长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNAs)是一类长度超过200个核苷酸的非编码RNA [ 5 ]。起初lncRNAs被认为是"转录噪音"，不具有生物学功能 [ 6 ]。但近十几年的广泛研究发现，lncRNAs已成为免疫疾病 [ 7 ]、癌症 [ 8 ]和心血管疾病 [ 9 ]等众多疾病病理生理过程的调节因子和潜在治疗靶点。目前，一些实验表明某些lncRNAs在内毒素诱导的脓毒症中也具有重要作用。例如，lncRNA-HOTAIR在内毒素诱导的脓毒症小鼠的心肌细胞中表达显著上调，其可通过激活NF-κB途径增强肿瘤坏死因子-α的产生 [ 10 ]。但是目前关于lncRNAs在儿童脓毒症发生发展中的作用及机制的研究报道较少。
我们的前期研究发现，脓毒症患儿外周血单核细胞F 1F O-ATPase活性显著低于健康对照儿童。因此，本研究拟利用lncRNAs测序技术，对脓毒症患儿及健康儿童外周血中mRNAs及lncRNAs的差异表达进行研究，旨在筛选出F 1F O-ATPase相关的lncRNAs，并初步探讨其在儿童脓毒症中的作用。
1　对象与方法
1.1　研究对象
选择2016年1月至12月在首都儿科研究所附属儿童医院ICU进行救治的脓毒症患儿23例及同期在本院进行体检的年龄性别与之匹配的健康儿童23例，患儿均符合《儿童脓毒性休克(感染性休克)诊治专家共识(2015版)》 [ 1 ]中有关儿童脓毒症的诊断标准。本研究经本院伦理委员会审核批准(SHERLL 2013082)，标本采集均经过患儿家属签署知情同意书。
1.2　主要试剂及仪器
PAXgeneBloodRNATube(BD，美国)，PAXgeneBloodRNAKit(QIAGEN，美国)，Ribo-ZeroTMrRNARemovalKit(Epicentre，美国)，紫外分光光度计Nanodrop2000(Thermo，美国)，Bioanalyzer2100(Agilent，美国)，Hiseq2500高通量测序仪(Illumina，美国)，QuantiFast ® SYBR ® GreenPCRKit试剂盒(Qiagen，德国)。
1.3　试验方法
1.3.1　标本收集
用PAXgeneBloodRNATube(BRT)采集受检者外周血2.5 ml，采血后立即颠倒采血管8～10次，室温静置24 h，然后转移至－20 ℃冰箱中，24 h后再移至－80 ℃冰箱保存备用。
1.3.2　样本总RNA提取及检测
按照PAXgeneBloodRNAKit操作说明书，对保存在BRT中的人类全血进行总RNA的提取和纯化。使用Nanodrop2000和Bioanalyzer2100检测总RNA的纯度和总RNA量，并结合琼脂糖凝胶电泳评估RNA的完整性。RNA完整值>7.0，吸光度( OD)260/280≥1.8且 OD 260 /230≥1.5的RNA样品被视为高纯度并用于后续试验。
1.3.3　文库构建及测序
选择年龄匹配的3例脓毒症患儿和3例健康儿童的外周血标本，提取总RNA经质检合格后，使用去除核糖体RNA的手段进行测序文库构建，构建的文库经Bioanalyzer2100及实时荧光定量PCR(qPCR)的方法质检合格后，使用IlluminaHiseq2500进行测序。以上具体步骤均委托联川生物技术股份有限公司完成。
1.3.4　差异lncRNAs及mRNAs的筛选及生物信息学分析
lncRNAs调控方式主要分为两类：顺式调控(cisregulation)和反式调控(transregulation)。我们将获得的测序数据进行预处理以及归一标准化处理等，按照差异倍数≥2，且 P<0.05的筛选标准筛选出差异表达显著的lncRNAs或mRNAs。采用RNAplex(http：//www.tbi.univic.ac.at/software/)算法对差异lncRNAs进行trans靶基因的预测。本研究中取cis与trans调控的并集作为最终lncRNAs的靶基因。对靶基因进行GO分析，从中找出与F 1F O-ATPase活性相关且在测序结果中差异表达的mRNAs，利用Cytoscape软件绘制特异的lncRNA-mRNA网络调控图。
1.3.5　实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)验证
进一步扩大样本量，选取另外的脓毒症患儿和健康儿童的外周血标本各20例，采用qRT-PCR技术对筛选结果中ATPase相关的部分mRNAs及lncRNAs进行验证。
1.4　统计学方法
采用SPSS 20.0统计学软件进行统计学分析，正态分布计量资料用均数±标准差( Mean± SD)表示，两组间均数比较采用 t检验， P<0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　差异lncRNAs及mRNAs筛选结果
与健康对照组相比，脓毒症组具有差异表达的lncRNAs共252个( 表1 所示为差异倍数在前20的lncRNAs)，其中表达上调的有86个，表达下调的有166个。另外，脓毒症组具有差异表达的mRNAs共2 652个，其中955个表达上调，1 697个表达下调。
lncRNAs ID 基因名称 差异倍数 P值 调控
ENST00000604191.1 AC090627.1 59.53 0.01 下调
ENST00000622077.1 LINC01002 57.39 0.03 上调
ENST00000586907.3 PSMD5-AS1 53.44 0.05 上调
ENST00000529979.3 MRVI1-AS1 50.29 0.02 上调
ENST00000428083.1 RHOA-IT1 42.52 0.04 上调
ENST00000578664.1 RP11-838N2.4-004 34.60 0.00 下调
ENST00000579007.3 RP11-838N2.4-003 34.60 0.00 下调
ENST00000621191.1 AC090627.1 33.89 0.00 下调
ENST00000570416.3 MIR22HG 33.71 0.01 上调
ENST00000554530.3 RP11-76E17.3 32.51 0.01 上调
ENST00000531076.1 RP11-326C3.12 32.48 0.04 上调
ENST00000609751.2 AC159540.1 31.08 0.00 下调
ENST00000609407.1 RP11-351D16.3 26.14 0.04 上调
ENST00000534483.1 RP11-326C3.12 17.93 0.02 上调
ENST00000534354.1 RP11-535A19.1 17.39 0.03 上调
ENST00000616716.2 AC159540.1 17.17 0.02 下调
ENST00000441749.1 AC021016.6 15.65 0.05 上调
ENST00000528019.3 RGS5 15.36 0.04 下调
ENST00000367716.3 RP11-296O14.3 14.20 0.05 上调
ENST00000624628.1 RP13-580B18.4 13.64 0.04 上调
脓毒症患儿外周血中差异表达的lncRNAs(差异倍数前20)

注：lncRNAs：长链非编码RNA。

2.2　差异lncRNAs的靶基因预测及网络互作分析
通过对差异lncRNAs进行靶基因预测并对这些靶基因进行GO分析发现，MT-ATP8和ATP5E与F 1F O-ATPase活性相关，其GO分析结果见 表2 、 表3 。
GO ID GO术语 GO功能
GO：0006200 ATP分解代谢过程 生物过程
GO：0015986 ATP合成偶联质子转运 生物过程
GO：0042776 线粒体ATP合成偶联质子转运 生物过程
GO：0044281 小分子代谢过程 生物过程
GO：0022904 呼吸电子传递链 生物过程
GO：0044237 细胞代谢过程 生物过程
GO：0000276 线粒体质子转运ATP合酶复合物，偶联因子F(o) 细胞组分
GO：0005753 线粒体质子转运ATP合成酶复合物 细胞组分
GO：0005743 线粒体内膜 细胞组分
GO：0016021 膜的组成部分 细胞组分
GO：0015078 氢离子跨膜转运蛋白活性 分子功能
GO：0022857 跨膜转运蛋白活性 分子功能
GO：0016887 ATP酶活性 分子功能
MT-ATP8的GO分析结果
GO ID GO术语 GO功能
GO：0006200 ATP分解代谢过程 生物过程
GO：0015986 ATP合成偶联质子转运 生物过程
GO：0042776 线粒体ATP合成偶联质子转运 生物过程
GO：0044281 小分子代谢过程 生物过程
GO：0022904 呼吸电子传递链 生物过程
GO：0044237 细胞代谢过程 生物过程
GO：0005753 线粒体质子转运ATP合成酶复合物 细胞组分
GO：0000275 线粒体质子转运ATP合成酶复合物，催化核心F(1) 细胞组分
GO：0005759 线粒体基质 细胞组分
GO：0022857 跨膜转运蛋白活性 分子功能
GO：0046933 质子转运ATP合成酶活性，旋转机制 分子功能
GO：0016887 ATP酶活性 分子功能
GO：0046961 质子转运ATP酶活性，旋转机制 分子功能
ATP5E的GO分析结果
另外，靶基因预测结果发现MT-ATP8和ATP5E可以作为多条lncRNAs共同作用的靶基因。如lncRNA ENST00000573866.2、ENST00000 580533.1、ENST00000595748.1、ENST00000 614735.2、ENST0000 0615535.1、ENST00000 616950.1、ENST00000618234.2、ENST00000 621933.1、ENST00000622077.1、ENST00000 624705.1均以MT-ATP8和ATP5E作为靶标。根据靶基因预测的结果，利用Cytoscape软件绘制以MT-ATP8和ATP5E为核心的lncRNA-mRNA网络调控图，见 图1 。
MT-ATP8及ATP5E相关的lncRNA-mRNA网络调控图

lncRNA：长链非编码RNA。

2.3　qRT-PCR验证结果
从同时以MT-ATP8和ATP5E作为靶基因的差异lncRNAs中挑选出5条在筛选结果中差异倍数较大的lncRNAs：ENST00000624705.1、ENST00000621933.1、ENST 00000616950.1、ENST00000615535.1、ENST000 00595748.1，以GAPDH作为内参基因，通过qRT-PCR,对MT-ATP8、ATP5E以及这5条lncRNAs进行扩大样本量验证。引物序列见 表4 、 表5 。
基因 引物序列(5′—3′) 产物长度(bp)
MT-ATP8 F：ACAAACTACCACCTACCTCC 103
  R：GCAATGAATGAAGCGAACAG  
ATP5E F：TTGGATGATGTTTGAAGCTGTC 150
  R：GCTTATCCTTTAGCAGTACGG  
GAPDH F：TGTTGCCATCAATGACCCCTT 201
  R：CTCCACGACGTACTCAGCG  
用于qRT-PCR验证的mRNAs及GAPDH的引物序列
lncRNAs 引物序列(5′—3′) 产物长度(bp)
ENST00000 624705.1 F：CTTCACTCACATACGATATGCG 118
  R：AAGATGTTTATACTGCCTCGG  
ENST00000 621933.1 F：AGACTCTGTTAATCAGCTTGC 86
  R：CTCCCACATAGGAGCTCAAA  
ENST00000 616950.1 F：ATCTCCTCTCTCTCACATGTC 105
  R：CACTCATCCCGCAGGATA  
ENST00000 615535.1 F：CGGAGCCTGAGAGGATTAT 163
  R：TGGTCTCGTCATCATCGG  
ENST00000 595748.1 F：AGAGGTAATGGACTGTTGGAA 109
  R：CATATACATGCAAGTCACAGGG  
用于qRT-PCR验证的lncRNAs的引物序列

注：lncRNAs：长链非编码RNA。

验证结果显示：lncRNA ENST00000621 933.1、ENST00000616950.1、ENST00000595748.1在脓毒症患儿外周血中表达升高( P<0.05)；MT-ATP8和ATP5E以及lncRNA ENST00000624705.1和ENST00000 615535.1在脓毒症患儿外周血中表达降低( P<0.05)，见 图2 、 图3 。
qRT-PCR验证lncRNAs的差异表达

lncRNA：长链非编码RNA。

定量PCR验证ATP5E和MT-ATP8的表达
3　讨论
脓毒症是机体对严重感染的一种失调反应，其特征是危及生命的器官功能障碍 [ 1 ]。脓毒症起病急，发展快，如不能尽早及时诊断和治疗，患者可迅速发展至多器官功能衰竭甚至死亡 [ 11 ]。而目前临床上使用的诊断标记物，如C-反应蛋白、降钙素原、白细胞等，虽然具有一定的诊断价值，但缺乏一定的敏感性和特异性 [ 12 ]。另外，由于脓毒症发病机制复杂 [ 13 , 14 , 15 ]，目前临床上针对脓毒症的治疗主要依赖有效的抗生素治疗、器官功能支持和清除感染源等，尚缺乏针对脓毒症的有效特异性治疗。
lncRNAs不能编码蛋白质，之前一直被认为是保守和无功能的，但在过去的十几年中，已经发现了lncRNAs的重要作用。lncRNAs可通过调节组蛋白修饰和染色质重塑，调节DNA甲基化，与转录因子相互作用，环化增强子以及在转录后水平修饰来调节基因和基因组活性 [ 16 , 17 ]。有研究表明，lncRNAs可以参与调节炎症细胞和介质的表达等，在免疫和炎症反应中起关键作用 [ 18 , 19 , 20 ]。而炎症反应平衡失调、免疫功能紊乱等在脓毒症的发生发展过程中具有重要作用。近年来，有实验人员也对lncRNAs在脓毒症中的作用进行了研究，发现某些lncRNAs可能是脓毒症治疗干预的潜在靶点。例如，下调lncRNAs TUG1可能通过调节miR-142-3p/SIRT1轴和NF-κB通路来促进脓毒症相关急性肾损伤的发生 [ 21 ]；lncRNAs MALAT1可能通过miR-125b的靶向参与调节脓毒症的心肌功能 [ 22 ]；lncRNAs GAS5可以抑制PTEN表达，进而调控PI3K/AKT途径，在脓毒症诱导的肾损伤中发挥重要作用 [ 23 ]。
机体一切生命活动的正常进行都依赖于ATP的能量供给。线粒体是通过氧化磷酸化为机体提供ATP的重要场所，因此，线粒体功能障碍及随后的ATP缺乏在多器官功能障碍的发展中起关键作用 [ 4 , 24 ]。线粒体功能障碍主要涉及线粒体内膜损伤、线粒体呼吸链损伤及线粒体DNA损伤等 [ 25 ]。F 1F O-ATPase(即线粒体呼吸链复合物Ⅴ，也称为ATPase)，是线粒体呼吸链中的重要成员，位于线粒体内膜中，是由至少16种不同类型的亚基组成的多亚基复合物 [ 26 , 27 ]。F 1F O-ATPase作为线粒体氧化磷酸化的关键酶，其活性变化可直接影响ATP的产生。目前，脓毒症患儿线粒体F 1F O-ATPase活性损伤的可能机制有：线粒体膜结构破坏 [ 28 ]、钙超载、炎症因子聚集 [ 29 , 30 , 31 ]、硝化作用 [ 32 ]、编码F 1F O-ATPase的基因发生突变等。F 1F O-ATPase的ε亚基，由核基因ATP5E编码，由两个不同的结构域即N末端夹心结构域和C末端螺旋发卡结构域构成 [ 33 ]。ε亚基是线粒体ATP合成酶的催化部分，可以将ADP和无机磷酸盐(Pi)催化产生ATP，有研究表明，ATP5E在调节ATP水解活性的机制中发挥作用 [ 34 ]。在酵母中，ε亚基的缺失可以促进质子泄露并抑制氧化磷酸化 [ 35 ]，所以，ε亚基在能量机制中具有重要作用。F O部分的A6L亚基，由线粒体基因组的ATP8编码 [ 36 ]。许多疾病的发生都与线粒体DNA(mtDNA)变异有关，这些变异会影响线粒体的功能 [ 37 ]。有研究发现，MT-ATP8基因突变会导致F 1F O-ATPase的结构异常和酶活性降低 [ 38 ]。本研究中，ATPase相关的MT-ATP8和ATP5E在脓毒症患儿外周血中表达降低。而脓毒症患儿MT-ATP8和ATP5E表达发生改变，可能影响F 1F O-ATPase的ε亚基和A6L亚基的结构，进而导致F 1F O-ATPase功能损伤，若其功能持续得不到改善，机体能量产生过程严重受阻，ATP合成不足，器官组织正常发挥功能所需的能量持续得不到供应，多器官功能衰竭的发生将不可避免，最终可能也会影响脓毒症患者的预后 [ 39 ]。
基因的表达可以受到lncRNAs的调控，本研究发现以MT-ATP8和ATP5E为靶基因的lncRNA ENST 0000062 1933.1、ENST 00000616 950.1、ENST00000595748.1在脓毒症患儿外周血中表达升高，ENST00000 624705.1和ENST00000 615535.1在脓毒症患儿外周血中表达降低。因此，我们有理由推测这5条lncRNAs(ENST00000624705.1、ENST00000621933.1、EN ST00000616950.1、ENST00000615535.1、ENST 00000595748.1)的表达水平可能与儿童脓毒症的发生发展有关。
但是本研究有一定的局限性，仅对筛选出的部分lncRNAs进行了初步验证，对于它们在儿童脓毒症发生发展中的具体作用及机制需要通过进一步的功能实验来证实。迄今为止，lncRNAs在脓毒症过程中的作用和机制研究仍不完善，对于其在儿童脓毒症中的研究更是不足，要找到可靠的用于脓毒症早期诊断和预后预测的生物标记物以及针对脓毒症的有效治疗靶点，仍需要研究者们进一步深入探索。
参考文献
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万方数据
备注信息
A
张琪，Email： mocdef.aabnis5530iqgnahz
B
所有作者均声明不存在利益冲突
C
北京市医院管理局临床技术创新项目 (XM201412)
北京市自然科学基金 (7172037)
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