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ENGLISH ABSTRACT
片段化睡眠对术后认知功能和中枢神经炎症的影响
卢波
刘荣君
孟波
袁桧
翟晓杰
李晓瑜
秦金玲
郑晋伟
吴国荣
陈骏萍
作者及单位信息
·
DOI： 10.3760/cma.j.cn112137-20191215-02734
Effect of fragmented sleep on postoperative cognitive function and central neuroinflammation
Lu Bo
Liu Rongjun
Meng Bo
Yuan Hui
Zhai Xiaojie
Li Xiaoyu
Qin Jinling
Zheng Jinwei
Wu Guorong
Chen Junping
Authors Info & Affiliations
Lu Bo
Department of Anesthesiology, Hwa Mei Hospital, University of Chinese Academy of Sciences, Ningbo 315010, China
Liu Rongjun
Department of Anesthesiology, Hwa Mei Hospital, University of Chinese Academy of Sciences, Ningbo 315010, China
Meng Bo
Department of Anesthesiology, Hwa Mei Hospital, University of Chinese Academy of Sciences, Ningbo 315010, China
Yuan Hui
Department of Anesthesiology, Hwa Mei Hospital, University of Chinese Academy of Sciences, Ningbo 315010, China
Zhai Xiaojie
Department of Anesthesiology, Hwa Mei Hospital, University of Chinese Academy of Sciences, Ningbo 315010, China
Li Xiaoyu
Department of Anesthesiology, Hwa Mei Hospital, University of Chinese Academy of Sciences, Ningbo 315010, China
Qin Jinling
Department of Anesthesiology, Hwa Mei Hospital, University of Chinese Academy of Sciences, Ningbo 315010, China
Zheng Jinwei
Department of Anesthesiology, Hwa Mei Hospital, University of Chinese Academy of Sciences, Ningbo 315010, China
Wu Guorong
Department of Anesthesiology, Hwa Mei Hospital, University of Chinese Academy of Sciences, Ningbo 315010, China
Chen Junping
Department of Anesthesiology, Hwa Mei Hospital, University of Chinese Academy of Sciences, Ningbo 315010, China
·
DOI： 10.3760/cma.j.cn112137-20191215-02734
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摘要

目的以老龄小鼠片段化睡眠（SF）模型模拟临床术后患者的睡眠模式，探讨术后片段化睡眠对围术期神经认知障碍（PND）和中枢神经炎症的影响。

方法32只老龄ICR小鼠随机分为4组（ n=8）：正常组（C组）、手术组（S组）、片段化睡眠组（F组）和手术+片段化睡眠组（D组）。于胫骨骨折内固定手术后进行片段化睡眠干预，采用新物体识别实验和条件性恐惧实验进行认知功能评估，采用ELISA检测海马炎症因子表达的变化。

结果新物体识别实验：C组、S组、F组和D组小鼠辨别指数（RI）分别为0.69±0.07、0.48±0.07、0.54±0.10、0.50±0.12，S组、F组和D组小鼠RI均显著低于C组（ t=4.885、3.521、4.433，均 P<0.01），S组和D组小鼠RI差异无统计学意义（ t=0.967 1， P>0.05）。场景恐惧实验：C组、S组、F组和D组小鼠僵直时间分别为（21.34±6.48）、（13.83±4.26）、（11.50±6.25）、（6.17±4.77）s，S组、F组和D组小鼠僵直时间均显著低于C组（ t=2.722、3.566、5.496， P<0.05或 P<0.01），D组小鼠僵直时间显著低于S组（ t=2.774， P<0.05）。线索恐惧实验：C组、S组、F组和D组小鼠僵直时间分别为（74.36±17.09）、（43.91±9.71）、（46.34±13.43）、（24.90±14.21）s，S组、F组和D组小鼠僵直时间均显著低于C组（ t=4.393、4.043、7.136，均 P<0.01），D组小鼠僵直时间显著低于S组（ t=2.743， P<0.05）。S组、F组和D组小鼠海马肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素（IL）-6和IL-1β均显著高于C组，D组小鼠海马TNF-α、IL-6显著高于S组，差异均有统计学意义（ P<0.05或 P<0.01）。

结论术后片段化睡眠加剧老龄小鼠术后认知功能损害，增加海马炎症因子的表达。

睡眠剥夺;认知障碍;手术后期间;中枢神经系统;炎症
ABSTRACT

ObjectiveTo investigate the effect of sleep fragmentation on perioperative neurocognitive disorders (PND) and central neuroinflammation by simulating sleep patterns of postoperative patients with sleep fragmentation in aged mice.

MethodsThirty-two elderly ICR mice were randomly divided into four groups ( n=8): normal group (C), surgery group (S), fragmented sleep group (F), and surgery+fragmented sleep group (D). Fragmented sleep was conducted after internal fixation of tibia fractures, cognitive function was evaluated by novel object recognition (NOR) and fear conditioning (FC) test, and changes in expression of inflammatory cytokines in hippocampus were detected by ELISA.

ResultsNOR test: the recognition index (RI) of mice in group C, group S, group F and group D was 0.69±0.07, 0.48±0.07, 0.54±0.10 and 0.50±0.12, respectively. The RI of mice in group S, group F and group D was significantly lower than that in group C ( t=4.885, 3.521 and 4.433, all P<0.01). There was no significant difference in RI between group S and group D ( t=0.967 1, P>0.05). Contextual FC test: the freezing time of mice in group C, group S, group F and group D was(21.34±6.48), (13.83±4.26), (11.50±6.25) and (6.17±4.77) s, respectively. The freezing time of mice in group S, group F and group D was significantly lower than that in group C ( t=2.722, 3.566, 5.496, P<0.05 or P<0.01). The freezing time of mice in group D was significantly lower than that in group S ( t=2.774, P<0.05). Cue FC test: the freezing time of mice in group C, group S, group F and group D was (74.36±17.09), (43.91±9.71), (46.34±13.43) and (24.90±14.21) s, respectively. The freezing time of mice in group S, group F and group D was significantly lower than that in group C ( t=4.393, 4.043 and 7.136, all P<0.01). The freezing time of mice in group D was significantly lower than that in group S ( t=2.743, P<0.05). The levels of TNF-α, IL-6 and IL-1β in hippocampus of mice in group S, F and D were significantly higher than those in group C, while the levels of TNF-α and IL-6 in hippocampus of mice in group D were significantly higher than those in group S, with statistically significant differences ( P<0.05 or P<0.01).

ConclusionPostoperative fragmented sleep aggravates postoperative cognitive impairment and increases the hippocampal neuroinflammation in aged mice.

Sleep deprivation;Cognition disorders;Postoperative period;Central nervous system;Inflammation
Chen Junping, Email: mocdef.3ab6137822285831
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引用本文

卢波,刘荣君,孟波,等. 片段化睡眠对术后认知功能和中枢神经炎症的影响[J]. 中华医学杂志,2020,100(17)：1341-1344.

DOI:10.3760/cma.j.cn112137-20191215-02734

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围术期神经认知障碍（PND）病因尚不明确，但已知的相关影响因素包括麻醉、手术、年龄、受教育程度、心理因素等，其中高龄是PND唯一确定的独立危险因素 [ 1 , 2 , 3 , 4 ]。睡眠剥夺（SD）可导致各种认知过程的损害，对于住院的手术患者，术后疼痛、饥饿以及病房声光干扰常常使得患者的睡眠反复被干扰和中断 [ 5 , 6 , 7 , 8 ]，此片段化的睡眠模式（SF）同样属于SD的范畴 [ 9 ]。目前对于术后SD是否加重老龄患者术后认知功能的损害尚不清楚。本研究以老龄小鼠SF模型模拟临床术后患者的睡眠模式，探讨术后片段化睡眠对PND和中枢神经炎症的影响。
材料与方法
1．实验动物：
雄性清洁级ICR小鼠32只，12~14月龄，由浙江省医学科学院实验动物中心提供。所有实验动物均饲养于宁波大学SPF级实验动物中心，所有操作符合《浙江省实验动物管理办法》。采用随机数字表法将小鼠分为4组（ n=8）：正常组（C组）、手术组（S组）、片段化睡眠组（F组）和手术+片段化睡眠组（D组）。
2．麻醉方法与围术期管理：
使用R540SP型七氟烷小动物麻醉机，箱内七氟烷浓度调节至3%，将小鼠放入箱内进行诱导，直至翻正反射消失。麻醉维持期调节七氟烷浓度为1.8%，空气流量为0.5 L/min，保持自主呼吸，控制麻醉维持时间为0.5 h。
3．片段化睡眠干扰模型：
采用Sinton等 [ 10 ]的方法，动物饲养于带有金属片的鼠笼内，放置于模拟轨道振动器上，并以固定的速度（100 r/min）和循环使轨道振动，以轨道的运动和金属摩擦产生声音作为唤醒刺激源使动物产生睡眠中断；睡眠干扰的循环时间设置为30 s开/90 s关，以实现30次/h的睡眠中断。实验时可将6个鼠笼同时放置于轨道平台上进行同步的片段SD和记录。在开始片段化睡眠干扰前3天，每天将轨道持续开动2 h（18∶00~20∶00），以使得小鼠对轨道的转动环境进行预适应，保证轨道运动期间小鼠在鼠笼内可以自由进食和饮水。片段化睡眠干扰的时间为24 h，结束后休息24 h，之后开始行为学测试。
4．胫骨骨折内固定手术模型：
小鼠左后肢、膝下、外侧备皮消毒；于胫骨粗隆水平作一小切口直至胫骨骨膜，并使用骨钻钻孔，直径约0.5 mm；将0.38 mm髓内固定钢针由此孔插入胫骨骨髓腔，深度约为15 mm。分离胫骨下2/3皮肤、肌肉，直至暴露骨膜，并将骨膜沿周围10 mm剥离；使用截骨钳将胫骨中下1/3交界处（约距钻孔处7 mm）截断；冲洗伤口，使用6-0丝线缝合伤口。于手术部位皮下注射0.3%罗哌卡因减少术后疼痛的影响。手术结束后，于伤口处涂抹红霉素软膏预防感染。
5．新物体识别实验：
将A、B两相同物体放入旷场箱内，让小鼠进行探索、训练5 min；3 h后，将B物体换为不同形状、不同质地的物体C，记录小鼠5 min内对两物体的探索时间（T），并计算辨别指数（recognition index，RI），RI=T C/（T A+T C），RI越高，表明动物对物体的识别记忆能力越强。
6．条件性恐惧实验：
训练期，小鼠在无声黑暗试验箱内适应3 min后，给予单一高频声音（30 s，70 dB，3 kHz）刺激，随后给予足底电击（2 s，0.7 mA）刺激，刺激结束后恢复30 s，循环2次后放回饲养笼。测试期，将小鼠再次放入实验箱内自由探索3 min，不给予任何刺激，记录场景诱发僵直，主要反映海马依赖性恐惧记忆；2 h后放入改造后实验箱（白色分隔板遮住通电栅栏，改变四周箱壁颜色），自由探索3 min后，给予上述相同声音刺激3 min，记录声音诱发僵直，主要反映非海马依赖性恐惧记忆。
7．小鼠术后海马炎症因子检测：
于吸入麻醉下处死小鼠并取脑，冰上迅速分离海马组织，用预冷的PBS冲洗去除残留血液，匀浆后以3 000 r/min离心10 min，取上清液置于-80 ℃冰箱保存。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测海马组织TNF-α、IL-6和IL-1β的含量，严格按照试剂盒说明书进行操作。
8．统计学处理：
统计分析和作图采用Graphpad prism 8.0。Kolmogorov-Smirnov法行正态性检验，符合正态分布的计量资料以 ± s表示。4组间比较采用单因素方差分析，若差异有统计学意义，则进行两两比较。 P<0.05为差异有统计学意义。
结果
1．片段化睡眠对老龄小鼠术后认知功能的影响（ 表1 ）：
组别 辨别指数 场景诱发僵直时间（s） 线索诱发僵直时间（s）
C组 0.69±0.07 21±6 74±17
S组 0.48±0.07 b 14±4 a 44±10 b
F组 0.54±0.10 b 12±6 b 46±13 b
D组 0.50±0.12 b 6±5 bc 25±14 bc
F值 9.40 10.41 17.30
P值 <0.01 <0.01 <0.01
片段化睡眠对老龄小鼠术后认知功能的影响（ ± s）

注：C组：正常组；S组：手术组；F组：片段化睡眠组；D组：手术+片段化睡眠组；与C组比较， a P<0.05， b P<0.01；与S组比较， c P<0.05

（1）新物体识别实验：S组、F组和D组小鼠RI均显著低于C组，差异均有统计学意义；S组和D组小鼠RI差异无统计学意义。（2）场景恐惧实验：4组小鼠的场景诱发僵直时间差异有统计学意义，S组、F组和D组小鼠僵直时间均显著低于C组，D组小鼠僵直时间显著低于S组，差异均有统计学意义。（3）线索恐惧实验：4组小鼠的线索诱发僵直时间差异有统计学意义，S组、F组和D组小鼠僵直时间均显著低于C组，D组小鼠僵直时间显著低于S组，差异均有统计学意义。
2．片段化睡眠对老龄小鼠术后海马炎症因子的影响（ 表2 ）：
组别 TNFα IL6 IL1β
C组 6±3 7±5 30±6
S组 13±4 a 13±3 a 49±9 b
F组 14±5 b 13±3 a 48±8 b
D组 20±6 bc 21±6 bd 54±6 b
F值 13.42 14.22 17.95
P值 <0.01 <0.01 <0.01
片段化睡眠对老龄小鼠术后海马炎症因子的影响（ ± s，μg/L）

注：TNF：肿瘤坏死因子；IL：白细胞介素；C组：正常组；S组：手术组；F组：片段化睡眠组；D组：手术+片段化睡眠组；与C组比较， a P<0.05， b P<0.01；与S组比较， c P<0.05， d P<0.01

S组、F组和D组小鼠海马TNF-α、IL-6和IL-1β均显著高于C组，D组小鼠海马TNF-α、IL-6显著高于S组，差异均有统计学意义。
讨论
SD可导致各种认知过程的损害。SF是非ICU病房术后患者常见的睡眠模式，与完全性SD或部分SD不同，SF并不缩短总的睡眠时间，其对睡眠的影响主要表现为反复出现的唤醒导致睡眠连续性中断，进而破坏睡眠的整体结构 [ 11 ]。本研究发现SF导致老龄小鼠物体识别记忆和条件性恐惧记忆显著受损。此外，胫骨骨折内固定术后的老龄小鼠认知功能显著减退，而在此基础上施加SF干预，进一步加重手术所致的条件性恐惧记忆损害。然而，Vacas等 [ 12 ]对胫骨骨折手术的成年小鼠施加24 h睡眠中断干扰，却发现并未进一步恶化恐惧记忆的损伤。高龄是PND的高危因素，老龄动物的认知功能更易受损 [ 1 , 2 ]，本研究选择老龄小鼠建立PND模型，而Vacas等 [ 12 ]的研究中使用的是成年动物，这可能是造成矛盾性研究结果的可能原因。最近一项研究表明 [ 13 ]，完全剥夺老龄小鼠术前8 h的睡眠，加重手术造成的空间记忆和恐惧记忆损伤，支持本研究的结论。
本研究中，SF干预并未加重PND小鼠物体识别记忆的损伤，PND所损伤的认知功能涉及多个方面，累及的相关脑区也存在差异性，临床中通常使用多维度、多方面的评估量表来诊断PND，因此动物研究也应该结合更多的行为学实验来综合评估认知功能。本研究SF干预可能更大程度地损伤了恐惧记忆，而对物体识别记忆无显著影响。另外，新物体识别实验本身可能不足以区分此种程度上的差异。
手术创伤和麻醉可活化免疫系统，激活外周免疫细胞，促进炎性细胞因子的释放，通过直接或间接作用进入脑部，促使中枢小胶质细胞活化，释放炎症介质，作用于神经元，最终引起认知功能下降 [ 14 , 15 ]。另一方面，中枢炎性细胞因子如IL-6、IL-1β和TNF-α与神经系统内的化学分子（包括血清素、胆碱能递质和谷氨酸类分子）共同调控机体的正常睡眠 [ 16 ]。当剥夺动物的正常睡眠时，可导致皮层TNF-α和海马IL-6水平上升，同时引起认知功能的下降；TNF-α受体基因敲除的小鼠睡眠得到有效改善 [ 17 , 18 ]。本研究结果显示，SF模型和PND模型老龄小鼠海马IL-6、IL-1β和TNF-α均显著增加，这与先前研究结果一致。此外，手术后给予SF干预进一步加重了PND模型小鼠的海马中枢炎症反应。这提示了SF加重手术所致的认知功能损害可能是通过增加了中枢炎症反应的程度而引起。
鉴于手术患者术后远期认知功能（>3个月）评估追踪困难，以及术后患者睡眠质量精确分析较难实现，目前尚未有临床研究针对SF与PND之间的联系进行观察分析。本研究通过动物实验，初步提示了围术期睡眠是PND发生发展的重要影响因素。但是，本研究中SF的程度（30次/h，持续24 h）远大于临床上非ICU病房手术患者所受到的睡眠干扰，因此仍需进一步的临床试验观察，并验证术后患者睡眠片段化对认知功能的影响。
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备注信息
A
陈骏萍，Email： mocdef.3ab6137822285831
B
所有作者均声明不存在利益冲突
C
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浙江省自然科学基金 (LQ19H090004)
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