LP17多肽对小鼠肠缺血再灌注损伤影响

孙学童; 季涛; 张宗兵; 孔令尚; 刘牧林; 何先弟

doi:10.3760/cma.j.issn.2095-7041.2014.04.015

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中华解剖与临床杂志

• 实验研究 •

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LP17多肽对小鼠肠缺血再灌注损伤影响

作者及单位信息

出版日期： 2014 -08 -06 ·

DOI： 10.3760/cma.j.issn.2095-7041.2014.04.015

Effect of LP17 on intestinal ischemia-reperfusion injury of mice

Authors Info & Affiliations

Sun Xuetong

Moster of Gastrointestinal Surgery, Bengbu Medical College, Anhui 233030, China

Ji Tao

Zhang Zongbing

Kong Lingshang

Liu Mulin

He Xiandi

Published： 2014 -08 -06 ·

DOI： 10.3760/cma.j.issn.2095-7041.2014.04.015

142

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摘要

目的探讨LP17多肽对小鼠肠缺血再灌注(IIR)损伤影响。

方法将36只小鼠按数字表法随机分为假手术组(S组)、IIR组(I/R组)、IIR+LP17对照肽治疗组(C1组)、IIR+LP17治疗组(C2组)，每组9只。肠系膜上动脉夹闭20 min制作小鼠IIR模型，于再灌注前5 min将药物注入小鼠腹腔，24 h后处死小鼠，检测血清中可溶性髓样细胞触发受体-1(sTREM-1)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的浓度，观察肠黏膜损伤程度，免疫组化法检测肝脏细胞的核因子-κB(NF-κB)的表达情况。

结果血清sTREM-1、血清TNF-α和肝脏细胞NF-κB在I/R组和C1组升高，分别为(1 686.34±55.98)pg/ml、(121.81±8.01)pg/ml、(3.36±0.62)表达和(1 643.73±65.45)pg/ml、(119.88±8.05)pg/ml、(3.21±0.94)分；在C2组降低，分别为(944.58±39.75)pg/ml、(65.92±4.91)pg/ml和(0.92±0.55)分，与I/R组和C1组比较，差异均有统计学意义( P值均<0.01)。光镜下S组小鼠小肠黏膜基本正常；I/R组和C1组绒毛破坏较重，绒毛坏死明显，黏膜下水肿、炎性细胞浸润更加明显，肠壁各层均变薄；C2组肠绒毛损伤明显减轻，其肠黏膜损伤评分与其他各组比较，差异均有统计学意义( P值均<0.01)。

结论LP17多肽通过调节TREM-1的信号转导通路，减轻NF-κB和TNF-α过度激活所致炎症反应，减轻IIR引起的肠黏膜及远隔脏器的损伤。

关键词：髓样细胞触发受体;LP17;肠缺血再灌注损伤;肠黏膜屏障

ABSTRACT

ObjectiveTo investigate effect on intestinal ischemia-reperfusion injury of mice injected with LP17.

Methods36 mice were divided into three groups randomly( n=9 in each group): Sham operation group(S group), intestinal ischemia-reperfusion group (I/R group), intestinal ischemia-reperfusion+ LP17 control peptide group (C1 group), intestinal ischemia-reperfusion+ LP17 treatment group (C2 group). Twenty min superior mesenteric artery occlusion in mice produced intestinal ischemia-reperfusion model, 5 min before reperfusion mice by intraperitoneal injection of the drug, 24 h after the mice were sacrificed and serum concentrations of triggering receptor expressed on myeloid cells(sTREM-1) and tumor necrosis factor-α(TNF-α) were observed mucosal the extent of damage, immune staining of liver cell expression of nuclear factor-κB(NF-κB).

ResultsThe concentration of serum sTREM-1, the concentration of serum TNF-α and staining integral of the NF-κB shown on liver cell in I/R group(1 686.34±55.98)pg/ml, (121.81±8.01)pg/ml and (3.36±0.62)and C1 group (1 643.73±65.45)pg/m, (119.88±8.05)pg/m, and 3.21±0.94 were the highest and significantly reduced in the C2 group (944.58±39.75)pg/ml, (65.92±4.91)pg/ml, and 0.92±0.55, compared with I/R group and C1 group, it was statistically significant(all P values<0.01). The small intestine mucosa of the mice in S group was normal under light microscope. The villi in I/R group and C1 group were damaged seriously, villus necrosis significantly; those in C2 group received less damage and the difference had statically significance(all P values<0.01).

ConclusionsLP17 can reduce inflammatory response caused by over activation of TNF-α and NF-κB, and reduce the damage of the intestinal mucosa and the distant organ caused by intestinal ischemia-reperfusion injury through regulating the signaling pathway of TREM-1.

KEYWORDS： Triggering receptor on myeloid cells;LP17;Intestinal ischemia-reperfusion injury;Intestinal mucosal barrier

Corresponding author: Liu Mulin, Department of Gastrointestinal Surgery, the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College, Anhui 233004, China, Email: mocdef.nabuyila66nilumuil

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引用本文

孙学童,季涛,张宗兵,等. LP17多肽对小鼠肠缺血再灌注损伤影响[J]. 中华解剖与临床杂志,2014,19(04)：320-323.

DOI:10.3760/cma.j.issn.2095-7041.2014.04.015

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肠缺血再灌注(intestinal ischemia-reperfusion, IIR)损伤是外科常见的组织器官损伤，是严重创伤、休克、感染等发生以及治疗过程中重要的病理生理过程。髓样细胞触发受体-1(triggering receptor expressed on myeloid cells，TREM-1)参与急性炎症反应，是炎症信号通路中的一个关键性的放大器 ^{[
1
]}。LP17多肽是TREM-1的拮抗肽 ^{[
2
,

3
]}。本实验应用LP17多肽研究其能否调节TREM-1的炎症信号通路，减轻肠黏膜屏障的损伤，为治疗IIR损伤提供实验依据。

1　材料与方法

1.1　主要材料与设备

1.1.1　实验动物

健康清洁级雄性昆明小鼠(蚌埠医学院动物实验中心提供)36只，体质量18～22 g。

1.1.2　主要仪器试剂

戊巴比妥钠(武汉金诺化工有限公司)，LP17多肽及LP17对照肽(上海生工生物工程有限公司)，鼠抗人单克隆核因子-κB(NF-κB)抗体(Sant Cruz公司，USA),即用型非生物素免疫组化ElivisionTM plus免疫组化试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司，产品编号KIT-9901)，DAB显色试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司，产品编号DAB-0031)，多功能酶标仪(美国BioTek公司)。

1.2　动物分组和模型制备

将36只健康清洁级昆明雄性小鼠按数字表法随机分为假手术组(S组)、IIR组(I/R组)、IIR+LP17对照肽治疗组(C1组)和IIR+LP17治疗组(C2组)，每组9只。参照文献[ 4 ]制备肠缺血再灌注模型：向小鼠腹腔注射3%戊巴比妥(1 ml/kg)麻醉，仰卧固定操作台上，腹部正中脱毛，碘伏消毒后铺巾，上腹部正中切口进腹(切口长2～3 cm)。右上腹找到并分离肠系膜上动脉，其中S组仅分离肠系膜上动脉，I/R组、C1组和C2组用无损伤血管夹于距肠系膜上动脉根部约0.5 cm处夹闭，若见肠系膜血管搏动消失且小肠颜色变苍白，提示肠缺血。在夹闭肠系膜上动脉期间，向小鼠腹腔间断注入生理盐水15～20 ml/kg，以防止或减轻松开血管夹后出现的一过性低血容量反应。20 min后将无损伤血管夹松开，若见肠系膜血管搏动恢复，肠管变红，表示IIR模型成功，然后关腹。其中C1组和C2组参照文献[ 5 ]于再灌注前5 min分别向腹腔注入LP17多肽(3.5 mg/kg, 1 mg溶于0.1 ml生理盐水)、LP17对照多肽(3.5 mg/kg, 1 mg溶于0.1 ml生理盐水)。各组分别于制模后24 h取血后处死动物留取标本。

1.3　ELISA检测小鼠血清可溶性TREM-1(sTREM-1)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的浓度

以sTREM-1为例：sTREM-1标准溶液配成不同浓度系列，在450 nm波长处读取吸光度(OD)值，以sTREM-1标准溶液不同浓度值为 X，相对应OD值为 Y，求得回归方程 Y＝k X+b，其中k为斜率，b为y坐标轴截距。采取摘眼球方法，采血2～3 ml，离心(2 000 r/min，10 min，离心半径13.5 cm，)后保存备测。小鼠外周血血清sTREM-1测定采用上双抗体夹心ELASA法：样品和生物素标记抗体先后加入酶标板孔反应后，PBS洗涤。随后加入过氧化物酶标记的亲和素反应；经过PBS的彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色，在450 mm波长处测得OD值，小鼠sTREM-1与OD值呈正比，根据标准曲线求出标本中sTREM浓度。

1.4　小肠组织病理学观察

于再灌注24 h剖腹取距回盲部约5 cm处的小肠组织5 cm，并将其纵形剖开，生理盐水冲洗后置于10%甲醛中固定，石蜡包埋，光镜下观察肠组织的损伤严重程度，进行肠损伤程度评分：0分，正常，绒毛上皮完整，组织结构正常；1分，绒毛轻度水肿，上皮脱落仅限于绒毛顶部；2分，绒毛轻度坏死；3分，绒毛中度坏死，肠隐窝清晰可见；4分，绒毛全部坏死，上皮结构完全消失。

1.5　免疫组化检测NF-κB

取小鼠肝组织，用10%中性甲醛固定液固定，石蜡包埋，连续切片2张，厚度为4 μm，Elivision免疫组化步骤：烤片，脱蜡，封闭，抗原修复，加一抗兔抗鼠单克隆NF-κB抗体(1∶100稀释)，加增强剂，加二抗酶标羊抗鼠/兔IgG复合物，加DAB显色剂，复染，脱水，封片。标本染色后以积分法半定量描述，由同一组病理科医生采用双盲法光镜下读片。

阳性结果判定标准为：NF-κB以胞质和/或胞核出现棕黄色染色为阳性细胞，按染色强度分为5级：0级阴性染色；1级弱阳性染色(淡黄色)；2级阳性染色(黄色)；3级中度阳性染色(深黄色)；4级强阳性染色(棕褐色)。每个切片随机取10个高倍视野，每个视野观察100个细胞，根据100个细胞阳性细胞数的不同分等级。按阳性细胞数占总细胞数的比例分为5级：0级阴性；1级阳性细胞1%～25%；2级阳性细胞26%～50%；3级阳性细胞51%～75%；4级阳性细胞76%～100%。染色积分＝染色强度×阳性细胞数占总细胞数的比例。

1.6　统计学方法

应用SPSS 17.0统计学软件包进行数据分析。正态分布计数资料采用

± s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 q检验；病理组织学检验采用秩和检验，双侧检测。以 P<0.05有统计学意义。

2　结果

2.1　各组小鼠血清sTREM-1和TNF-α浓度比较

I/R组和C1组的血清sTREM-1浓度和血清TNF-α浓度均高于S组和C2组，C2组亦高于S组，差异均有统计学意义( P值均<0.01)；而C1组略低于I/R组，差异无统计学意义( P>0.05)。见表1 。

组别	样本	sTREM-1	TNF-α
S组	9	135.49±26.38	5.86±1.47
I/R组	9	1 686.34±55.98 ^ab	121.81±8.01 ^ab
C1组	9	1 643.73±65.45 ^ab	119.88±8.05 ^ab
C2组	9	944.58±39.75 ^ab	65.92±4.91 ^ab
F值	—	1 315.262	464.939
P值	—	0.000	0.000

表14组小鼠血清髓样细胞触发受体-1浓度和肿瘤坏死因子-α浓度比较(

± s, pg/ml)

注：S：假手术；I/R：肠缺血再灌注；C1：肠缺血再灌注+LP17对照肽治疗；C2：肠缺血再灌注+LP17治疗；与S组比较， ^a P<0.01；与C2组比较， ^b P<0.01

2.2　各组小鼠肠组织病理学观察及评分

各组小鼠肠黏膜损伤程度在HE染色显微镜下观察比较：S组小鼠小肠黏膜基本正常；I/R组和C1组绒毛破坏较重，出现明显的绒毛坏死，黏膜下水肿、炎性细胞浸润更加明显，肠壁各层均变薄；C2组损伤较轻，可见肠黏膜绒毛顶部上皮脱落，黏膜下水肿，毛细血管扩张、淤血，炎性细胞浸润等。I/R组肠黏膜损伤程度比S组严重，C2组比I/R组及C1组减轻，差异均有统计学意义( P值均<0.05)；C1组与I/R组比较无明显变化，差异无统计学意义( P>0.05)。见表2 及图1 。

组别	样本	0分	1分	2分	3分	4分
S组	9	6	3	0	0	0
I/R组	9	0	0	0	3	6
C1组	9	0	0	1	2	6
C2组	9	0	3	3	3	0

表24组小鼠肠黏膜损伤评分比较

注：S：假手术；I/R：肠缺血再灌注；C1：肠缺血再灌注+LP17对照肽治疗；C2：肠缺血再灌注+LP17治疗；S组与I/R组比较， Hc＝45.0， P<0.01；C1组与S组比较， Hc＝45.0， P<0.01；C2组与S组比较， Hc＝49.5， P<0.01; C1组与I/R组比较， Hc＝84.0， P＝0.873；C2组与I/R组比较， Hc＝49.5， P<0.01；C2组与C1组比较， Hc＝55.5， P<0.05

图1 各组小鼠肠组织镜下结构病理变化(HE ×100)图2 各组小鼠肝组织核因子-κB的表达(免疫组化　×400)　2a假手术组　2b肠缺血再灌注组　2c肠缺血再灌注+LP17对照肽治疗组　2d肠缺血再灌注治疗组

2.3　各组小鼠肝组织NF-κB免疫组化及染色积分

S组小鼠肝细胞NF-κB表达呈阴性或弱阳性，且弱阳性表达的细胞数占总细胞的比例低；I/R组及C1组小鼠肝细胞NF-κB表达呈中度阳性或强阳性，且阳性细胞质和细胞核都含有棕黄色颗粒，部分以细胞核为主；C2组小鼠肝细胞NF-κB表达的强度和阳性细胞数降低，I/R组和C1组的小鼠肝脏组织NF-κB免疫组化染色积分均高于S组和C2组，C2组亦高于S组，差异均有统计学意义( P值均<0.01)；C1组与I/R组相比，差异无统计学意义( P>0.05)。见表3 及图2 。

组别	例数	染色积分	F值	P值
S组	9	0.05±0.08
I/R组	9	3.36±0.62 ^ab
C1组	9	3.21±0.94 ^ab	62.63	<0.01
C2组	9	0.92±0.55 ^a

表34组小鼠肝脏组织核因子-κB免疫组化染色积分比较( ± s，分)

注：S：假手术；I/R：肠缺血再灌注；C1：I/R+LP17对照肽治疗；C2：I/R+LP17治疗；与S组比较， ^a P<0.01；与C2组比较， ^b P<0.01

3　讨论

TREM是一种表达于髓样细胞的与DAP12相关性的免疫球蛋白超家族跨膜受体 ^{[
6
]}。TREM-1通过其跨膜区的带正电荷的赖氨酸残基与接头蛋白DAP12跨膜区的带负电荷的天冬氨酸相偶联，并且通过DAP12胞浆区的免疫受体酪氨酸活化基序来传递活化信号 ^{[
6
,

7
]}。TREM-1和Toll类受体(Toll-like receptors, TLRs)信号通路有协同促进炎症反应的作用，TREM-1的激活可增强、放大TLRs(主要是TLR2、4)介导的炎症反应，可以导致NF-κB转录复合物的激活，引起致炎基因转录 ^{[
8
,

9
]}，引起TNF-α、IL-1β、GM-CSF分泌增加，同时抑制IL-10的分泌 ^{[
10
,

11
]}。上述炎症信号通路的激活最终可以引起炎症反应的增强放大，从而导致过度炎症反应。

sTREM-1是Gibot等 ^{[
11
]}于脓毒症大鼠的外周血中发现的，它很可能与TREM-1基因转录有关。Gibot等 ^{[
3
,

5
]}合成了一种多肽LP17，它是TREM-1的拮抗肽，与TREM-1的胞外区结构相似，可以竞争TREM-1未知的天然配体；LP17可以减少LPS刺激下体外培养的单核细胞分泌的TNF-α、IL-1β量，并且具有剂量依赖性。本实验显示：(1)LP17治疗小鼠IIR损伤后，小鼠肝组织免疫组化显示NF-κB的表达强度较I/R组明显减弱，且NF-κB阳性表达的肝细胞数亦明显减少( P<0.05)，表明LP17治疗后，NF-κB的强度及活性下降，降低炎性因子的表达，减轻肠道和肝组织的炎性反应。(2)LP17治疗后小鼠血清中的TNF-α和sTREM-1的浓度较缺血再灌注组小鼠相比显示明显减轻( P<0.05)。表明LP17可能与TREM -1的胞外区结合，抑制TREM-1与TLRs信号通路的协同促进炎症反应的作用，减轻、消弱了TLRs介导的炎症反应，抑制TNF-α的分泌，减弱炎症信号的转导。(3)LP17治疗后，镜下显示小鼠小肠组织的损伤程度较I/R组明显减轻。可能是LP17通过对TREM-1的旁路调节，减轻了肠缺血再灌注所致肠黏膜损害。LP17通过调节TREM-1的信号转导通路，减轻NF-κB和TNF-α过度激活所致炎症反应，减轻IIR引起的肠黏膜及远处脏器的损伤。因此，调控TREM-1可能成为治疗IIR损伤的一个潜在靶点。

摘要
1　材料与方法
2　结果
3　讨论
参考文献

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备注信息

通信作者：刘牧林，Email: mocdef.nabuyila66nilumuil

基金项目：

安徽省教育厅科研资助项目 (2006kj103c) 查看更多基金信息

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