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• 新型冠状病毒专题 •
ENGLISH ABSTRACT
包被抗原种类对抗新型冠状病毒抗体胶体金测试卡检测质量的影响
胡勇
周志军
岳胜兰
冯璐
林连珍
梅宇
谢勇
周东波
何彦林
李陶敬
李策生
作者及单位信息
·
DOI： 10.3760/cma.j.cn311962-20201019-00101
Effect of coated antigen types on quality of anti-2019 novel coronavirus antibody colloidal gold test cassettes
Hu Yong
Zhou Zhijun
Yue Shenglan
Feng Lu
Lin Lianzhen
Mei Yu
Xie Yong
Zhou Dongbo
He Yanlin
Li Taojing
Li Cesheng
Authors Info & Affiliations
Hu Yong
Research & Development Department, Sinopharm Wuhan Plasma-derived Biotherapies Co., Ltd., Wuhan 430207, China
Zhou Zhijun
Research & Development Department, Sinopharm Wuhan Plasma-derived Biotherapies Co., Ltd., Wuhan 430207, China
Yue Shenglan
Research & Development Department, Sinopharm Wuhan Plasma-derived Biotherapies Co., Ltd., Wuhan 430207, China
Feng Lu
Research & Development Department, Sinopharm Wuhan Plasma-derived Biotherapies Co., Ltd., Wuhan 430207, China
Lin Lianzhen
Research & Development Department, Sinopharm Wuhan Plasma-derived Biotherapies Co., Ltd., Wuhan 430207, China
Mei Yu
Research & Development Department, Sinopharm Wuhan Plasma-derived Biotherapies Co., Ltd., Wuhan 430207, China
Xie Yong
Research & Development Department, Sinopharm Wuhan Plasma-derived Biotherapies Co., Ltd., Wuhan 430207, China
Research & Development Center, Beijing Tiantan Biological Products Co., Ltd., Beijing 100024, China
Zhou Dongbo
Research & Development Center, Beijing Tiantan Biological Products Co., Ltd., Beijing 100024, China
He Yanlin
Research & Development Department, Sinopharm Wuhan Plasma-derived Biotherapies Co., Ltd., Wuhan 430207, China
Research & Development Center, Beijing Tiantan Biological Products Co., Ltd., Beijing 100024, China
Li Taojing
Research & Development Center, Beijing Tiantan Biological Products Co., Ltd., Beijing 100024, China
Li Cesheng
Research & Development Department, Sinopharm Wuhan Plasma-derived Biotherapies Co., Ltd., Wuhan 430207, China
·
DOI： 10.3760/cma.j.cn311962-20201019-00101
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摘要

目的考察包被不同种类的胶体金标记(金标)抗原对抗新型冠状病毒(2019 novel coronavirus，2019-nCoV)抗体快速检测测试卡检测质量的影响。

方法采用抗2019-nCoV抗体样本盘检测厂家L包被有不同金标抗原的胶体金测试卡，比较产品的灵敏度、特异度、准确度和正确指数，暂时以准确度>95%、正确指数>0.85为合格标准。

结果厂家L的6个批次分别包被有重组2019-nCoV的刺突(spike，S)+核衣壳(nucleocapsid，N)蛋白(L002)、受体结合域(receptor-binding domain，RBD)+N蛋白(L003)、N蛋白(L004)、RBD蛋白(L006)、S蛋白(L007)、N+S蛋白(L008)的测试卡，检测IgG的准确度/正确指数分别为98.38%/0.966、97.30%/0.946、97.84%/0.954、90.82%/0.873、97.86%/0.958、95.72%/0.919；检测IgM的准确度/正确指数分别为90.51%/0.736、95.57%/0.890、73.10%/0.298、68.37%/0.331、83.96%/0.533、87.17%/0.658。

结论所有金标抗原包被的测试卡检测IgG均合格，只有RBD与N蛋白组合的包被金标抗原测试卡检测IgM合格，通过优化包被的金标抗原种类可提高测试卡检测IgM的质量。

胶体金测试卡;新型冠状病毒;免疫球蛋白M;免疫球蛋白G;准确度;正确指数
ABSTRACT

ObjectiveTo investigate the effect of different types of coated gold-labeled antigens on the quality of anti-2019 novel coronavirus (2019-nCoV) antibody rapid detection test cassettes.

MethodsAn anti-2019-nCoV antibody sample panel was used to test colloidal gold test cassettes coated with different gold-labeled antigens from manufacturer L. The sensitivity, specificity, accuracy and correctness index of the product were compared. For the time being, the eligibility standard was set at accuracy >95% and correctness index >0.85.

ResultsFor the 6 batches of test cassettes from manufacturer L coated with recombinant 2019-nCoV spike (S)+ nucleocapsid (N) proteins (L002), receptor-binding domain (RBD)+ N proteins (L003), N protein(L004), RBD protein(L006), S protein(L007), N+ S proteins (L008), the accuracies/correctness indexes of detecting IgG were 98.38%/0.966, 97.30%/0.946, 97.84%/0.954, 90.82%/0.873, 97.86%/0.958, 95.72%/0.919, respectively, and those of detecting IgM were 90.51%/0.736, 95.57%/0.890, 73.10%/0.298, 68.37%/0.331, 83.96%/0.533, 87.17%/0.658, respectively.

ConclusionsTest cassettes coated with all kinds of gold-labeled antigens are qualified for IgG detection, but only the combination of RBD and N proteins coated test cassette is qualified for IgM detection. The quality of IgM detection can be improved by optimizing the types of gold-labeled antigens coated.

Colloidal gold test cassettes;2019 novel coronavirus;Immunoglobulin M;Immunoglobulin G;Accuracy;Correctness index
Li Taojing, Email: mocdef.mabrahponiisgnijoatil;
Li Cesheng, Email: mocdef.mabrahponisgnehsecil

Hu Yong and Zhou Zhijun have contributed equally to the article

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引用本文

胡勇,周志军,岳胜兰,等. 包被抗原种类对抗新型冠状病毒抗体胶体金测试卡检测质量的影响[J]. 国际生物制品学杂志,2021,44(03)：129-132.

DOI:10.3760/cma.j.cn311962-20201019-00101

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2019年12月，新型冠状病毒(2019 novel coronavirus，2019-nCoV或severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)引起的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)在全球暴发 [ 1 ]，研究显示其传播能力强，R 0约为2.2 [ 2 ]。2020年3月4日国家卫生健康委员会颁布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》将抗2019-nCoV特异性抗体血清学检测纳入诊断标准 [ 3 ]。首批通过国家药品监督管理局应急审批的两款抗体试剂盒均基于胶体金法。其后我国已有多个厂家迅速研发出抗2019-nCoV IgM/IgG抗体检测试剂盒(胶体金法)。
目前国内抗2019-nCoV抗体胶体金检测卡所用抗原有重组表达的2019-nCoV的核衣壳(nucleocapsid，N)、受体结合域(receptor-binding domain, RBD)和全长刺突(spike，S)蛋白的1种或者2种的组合，选用抗原不同导致检测卡的质量存在差异。我们所用的抗2019-nCoV抗体血清盘是经过优化的有代表性的COVID-19康复者(2019-nCoV核酸检测均为阴性)灭活血浆。评估显示国内几家胶体金产品对抗2019-nCoV IgG的检测已经成熟，但是对抗2019-nCoV IgM的灵敏度和特异度有待提高 [ 4 ]。本研究对厂家L用不同抗原组合包被的胶体金测试卡进行质量评估，以获取检测IgM准确度较高的最佳包被抗原种类。
1　材料和方法
1.1　抗2019-nCoV抗体胶体金测试卡
测试卡购自杭州隆基生物技术有限公司(厂家L)，6个批次，分别为科研批L002、L003、L004、L006、L007、L008，包被的胶体金标记(金标)重组表达抗原分别为高浓度S蛋白+N蛋白(L002)、RBD蛋白+N蛋白(L003)、N蛋白(L004)、RBD蛋白(L006)、S蛋白(L007)、高浓度N蛋白+S蛋白(L008)。组合抗原编号排序规定为浓度高的蛋白+浓度低的蛋白。
1.2　抗2019-nCoV抗体样本盘
IgG抗体阳性样本盘：COVID-19康复者恢复期病毒灭活血浆IgG(+)IgM(+)58份、IgG(+)IgM(-)30份，合计88份样本；其中58份双阳性血浆作为抗体IgM阳性样本盘，30份IgG(+)IgM(-)样本纳入IgM阴性盘。抗体双阴性样本盘：105份IgG(-)IgM(-)的健康人血清或血浆样本。
1.3　胶体金检测法
将样本盘的样本进行编号，并将编号标记于测试卡上。在测试卡的样品孔中加入10 μl样本(血浆/血清)。滴加2～3滴稀释液，15～20 min观察测试卡的质控线和检测线是否显色，并记录结果。结果判断见 图1 。
抗新型冠状病毒IgG/IgM抗体测试卡结果示意图　 A 　测试前　 B 　阴性结果，质控线显色，检测线不显色　 C 　IgG阳性、IgM阴性　 D 　IgG阴性、IgM阳性　 E 　IgG阳性、IgM阳性　 F 　无效结果，质控线不显色
1.4　统计学处理
用Excel 2013软件记录检测结果，按以下公式进行统计分析。
准确度(总符合率)＝(真阳性数+真阴性数)/总样本数×100%
灵敏度＝真阳性数/(真阳性数+假阴性数)×100%
特异度＝真阴性数/(真阴性数+假阳性数)×100%
正确指数(约登指数)＝灵敏度+特异度-1
通过比较准确度和正确指数来评判测试卡质量的优劣，暂定合格标准为：准确度>95%、正确指数>0.85，两者结果越高则测试卡质量越好。
2　结果
2.1　单组分蛋白作为包被抗原的测试卡检测IgG和IgM比较
采用L004、L006、L007批测试卡对不同数量的抗2019-nCoV抗体IgG阳性样本、IgG阴性样本，抗2019-nCoV抗体IgM阳性样本、IgM阴性样本进行检测，结果见 表1 和 表2 。无论哪种蛋白单独包被，IgG的准确度均大于90%，正确指数RBD低于S和N蛋白，原因在于其敏感度和特异度均低于后两者；IgM的准确度和正确指数顺序均为S>RBD>N蛋白。综合考量IgG检测，S和N蛋白单独包被均能满足要求，IgM检测3个蛋白单独包被均不合格，特别是正确指数均低于0.6，需要进行不同蛋白的组合以提高IgM的检测质量。
抗原 阳性 阴性 灵敏度/% 特异度/% 准确度/% 正确指数
RBD(L006)            
  阳性盘( n＝71) 62 9 87.32 100.00 90.82 0.873
  阴性盘( n＝27) 0 27
S(L007)            
  阳性盘( n＝88) 87 1 98.86 96.97 97.86 0.958
  阴性盘( n＝99) 3 96
N(L004)            
  阳性盘( n＝84) 81 3 96.43 99.01 97.84 0.954
  阴性盘( n＝101) 1 100
包被不同单组分抗原的胶体金测试卡检测IgG结果

注：RBD:受体结合域；S:刺突；N:核衣壳

抗原 阳性 阴性 灵敏度/% 特异度/% 准确度/% 正确指数
RBD(L006)            
  阳性盘( n＝46) 17 29 36.96 96.15 68.37 0.331
  阴性盘( n＝52) 2 50
S(L007)            
  阳性盘( n＝57) 33 24 57.89 95.38 83.96 0.533
  阴性盘( n＝130) 6 124
N(L004)            
  阳性盘( n＝55) 17 38 30.91 98.89 73.10 0.298
  阴性盘( n＝90) 1 89
包被不同单组分抗原的胶体金测试卡检测IgM结果

注：RBD:受体结合域；S:刺突；N:核衣壳

2.2　不同蛋白组合作为包被抗原的测试卡检测IgG和IgM比较
采用L002、L003、L008批测试卡对不同数量的抗2019-nCoV抗体IgG阳性样本、IgG阴性样本，抗2019-nCoV抗体IgM阳性样本、IgM阴性样本进行检测，结果见 表3 和 表4 。结果显示任何一种蛋白组合包被检测IgG均能达到要求，综合评判质量：S+N>RBD+N>N+S；蛋白组合包被后IgM检测的质量有较大提高，正确指数均高于0.65，准确度均>87%。综合考量建议选择两个指标最优的RBD+N的蛋白组合作为检测IgG和IgM的分型测试卡(即一个测试卡同时检测IgG和IgM)的最佳包被蛋白。
抗原 阳性 阴性 灵敏度/% 特异度/% 准确度/% 正确指数
S+N(L002)            
  阳性盘( n＝84) 82 2 97.62 99.01 98.38 0.966
  阴性盘( n＝101) 1 100
RBD+N(L003)            
  阳性盘( n＝84) 82 2 97.62 97.03 97.30 0.946
  阴性盘( n＝101) 3 98
N+S(L008)            
  阳性盘( n＝88) 88 0 100.00 91.92 95.72 0.919
  阴性盘( n＝99) 8 91
包被不同组合抗原的胶体金测试卡检测IgG结果

注：S:刺突；N:核衣壳；RBD:受体结合域

抗原 阳性 阴性 灵敏度/% 特异度/% 准确度/% 正确指数
S+N(L002)            
  阳性盘( n＝55) 41 14 74.55 99.03 90.51 0.736
  阴性盘( n＝103) 1 102
RBD+N(L003)            
  阳性盘( n＝55) 50 5 90.91 98.06 95.57 0.890
  阴性盘( n＝103) 2 101
N+S(L008)            
  阳性盘( n＝57) 41 16 71.93 93.85 87.17 0.658
  阴性盘( n＝130) 8 122
包被不同组合抗原的胶体金测试卡检测IgM结果

注：S:刺突；N:核衣壳；RBD:受体结合域

3　讨　论
胶体金是由氯金酸在还原剂作用下聚合成的特定大小金颗粒，由于静电作用成为稳定的胶体状态。胶体金颗粒在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，因此不影响蛋白质的生物特性。胶体金还可与许多生物大分子如葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素和激素等非共价结合，因而是免疫应答的优良标记物 [ 5 ]。胶体金技术基于胶体金免疫层析技术，是用于检测人血清、血浆和指尖全血样本中抗2019-nCoV IgM和IgG抗体的即时检测技术之一 [ 6 ]。胶体金层析技术成熟，已被广泛应用于传染病如甲型流感、艾滋病等的诊断 [ 7 ]。
用于临床诊断中抗2019-nCoV IgM/IgG抗体检测主要有ELISA、化学发光法和胶体金法。ELISA步骤多，对检测分析人员的技术水平要求较高，需要使用酶标仪，化学发光法必须使用与试剂配套的专用仪器设备。胶体金法具有灵敏度和特异度较好、成本低、方便快捷的特点，但其检测结果有呈假阴性、假阳性可能，主要与包被的金标重组病毒抗原种类和浓度、抗人IgG/IgM抗体种类和浓度比例有关。本研究仅对包被的金标抗原种类进行了初步摸索，为提高产品质量提供数据。厂家L的结果显示：3种抗原任何组合的测试卡对IgG检测质量均合格，但是单独使用重组表达的病毒N、RBD、S蛋白，对IgM检测的质量低于2种蛋白的组合，其中RBD和N蛋白组合质量最佳。对于抗2019-nCoV IgG/IgM分型测试卡，可在以RBD和N蛋白组合为包被金标抗原的基础上进一步优化出IgM检测质量更高的产品。
核酸检测对标本的储存和运输要求严格，需要专业的人员和设备，难以普及。有报道2019-nCoV无症状感染者血液中可能含病毒RNA [ 8 ]，但2019-nCoV核酸在血样中检出率低，仅在病毒血症期可以检测到，只有30%的COVID-19患者血液中能检测到病毒核酸。通常患者在感染早期出现IgM，在感染中晚期出现IgG应答，并且抗体可在血液循环中存在较长时间 [ 9 , 10 ]，因此检测病毒特异抗体可以用来辅助诊断有无近期或既往2019-nCoV感染，有助于对核酸检测阴性但临床疑似者的诊断。抗体产生后可在体内长期存在，1项对SARS患者的研究发现，12年后仍可在体内检测到SARS冠状病毒特异性抗体 [ 11 ]，因此分子生物学技术等诊断方法如抗体检测，在流行病学调查等方面有一定的替代意义。经过筛选优化，胶体金检测的灵敏度、特异度均可达到要求，且检测快速便捷。目前胶体金主要是定性检测，但是通过调整包被抗原浓度组合、调整抗人IgG和IgM浓度、优化阻断剂等方式，未来胶体金可以向半定量方向发展，用途将更广泛。
参考文献
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百度学术
万方数据
备注信息
A
李陶敬，Email: mocdef.mabrahponisgnijoatil；
B
李策生，Email: mocdef.mabrahponisgnehsecil
C

胡勇和周志军对本文有同等贡献

D
所有作者均声明不存在利益冲突
E
国家科技部重点专项 (2020YFC0841800)
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