液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）是临床生化小分子检测的首选方法，常用于血清25-羟维生素D［25（OH）D］的检测。其虽有高灵敏度、高特异性、线性范围宽等优势，但因仪器、色谱柱、试剂、校准物、方法学及性能验证等因素的影响，也会造成同一个实验室内部及不同实验室之间的LC-MS/MS检测结果存在较大偏差。标准化是确保在不同实验室、不同质谱仪器及不同时间，获得一致性和可比性结果的必要条件。为规范LC-MS/MS检测25（OH）D的方法，该共识基于目前现有的临床质谱相关指导文件和临床实践，针对同位素稀释LC-MS/MS的标准物质和内标物选择、方法验证、色谱质谱参数选择、质量控制、人员要求及参考区间等方面提出建议，旨在提高检验结果的准确性及可靠性。
Liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) is the preferred testing method for measurement of clinical biochemical small molecule, it is often used for measuring serum level of 25-hydroxyvitamin D [25(OH)D]. However, due to various influence factors including instrumentation, chromatographic conditions, reagents, calibrators, methodology, and method validation, obtained 25(OH)D results might differ significantly. 25(OH)D measured by LC-MS/MS assays may generate high intra- and inter-laboratory variations, despite known advantages of high sensitivity, high specificity, and wide linear range of LC-MS/MS. Standardization is the key point to ensure consistent and comparable results obtained from different laboratories, mass spectrometers and testing times. Here we form the consensus to standardize the LC-MS/MS method for the measurement of serum 25-hydroxyvitamin D. The consensus is developed based on the current clinical mass spectrometry-related guidance documents and clinical practice. For assay based on isotope-labeled dilution LC-MS/MS method, recommendations are focused on selection of standard substances, internal standards, method validation, parameters for LC and MS/MS, quality control, personnel requirements, and reference intervals to improve the accuracy and reliability of the test results.
中国老年保健医学研究会检验医学分会,中国老年医学学会检验医学分会. 液相色谱-串联质谱法检测25-羟维生素D标准化专家共识[J]. 中华检验医学杂志,2021,44(07)：587-595.
DOI:10.3760/cma.j.cn114452-20201120-008461.标准曲线和质控样品的准备：在室温下精确量取150 μl超纯水到标准物质或质控物试剂瓶中，漩涡混匀至冻干粉完全溶解后备用（如瓶塞上存在粉末，请加塞后上下颠倒数次至冻干粉溶解），瓶塞不得混用。标准物质和质控物的靶值见相应批次产品的赋值证书。
2.内标溶液的准备：取试剂盒中内标液，在室温下复温5 min，开瓶直接使用。
3.样本前处理：（1）精密移取25 μl的蛋白沉淀剂于96孔过滤板中；（2）精密加入200 μl内标液；（3）精密加入100 μl样品（标准曲线样品、质控样本、血清样本）；（4）置于96孔板振荡器，以600 r/min涡旋10 min；（5）在96孔过滤板下方放置96孔接收板，在4 000 r/min离心5 min；（6）取下96孔接收板，封板后使用液相色谱串联质谱仪方法进行检测。
1. 液相色谱洗脱条件：以2.6 μm，3.0×100 mm PFP（全氟苯基）色谱柱为例，使用者可根据实验室需要进行条件优化（ 附表1 ）。
| 时间（min） | 流动相A（%） | 流动相B（%） |
|---|---|---|
| 0 | 22 | 78 |
| 2.0 | 22 | 78 |
| 2.1 | 10 | 90 |
| 2.6 | 10 | 90 |
| 2.7 | 40 | 40 |
| 2.8 | 40 | 40 |
| 2.81 | 22 | 78 |
| 3.0 | 22 | 78 |
2. 质谱条件：使用者可以有效提高检测灵敏度为目标，优化离子源参数和化合物参数。可采用针泵连续进样的方式，手动建立或自动优化多反应监测（MRM）定量分析的质谱参数。质谱的电离方式、离子源温度、去簇电压、碰撞能对分析物的响应强度影响较大，需对这些参数分别寻优，使化合物的信号灵敏度最高，且稳定性良好，可参考 附表2 。
| 化合物 | 母离子（m/z） | 碎片离子（m/z） | 驻留时间（ms） | 碰撞能（V） |
|---|---|---|---|---|
| 25（OH）D 2-1 | 413.3 | 271.2 | 50 | 20 |
| 25（OH）D 2-2 | 413.3 | 133.1 | 50 | 40 |
| 25（OH）D 3-1 | 401.3 | 257.2 | 50 | 20 |
| 25（OH）D 3-2 | 401.3 | 121.1 | 50 | 33 |
| 25（OH）D 2-IS-1 | 416.3 | 274.2 | 50 | 20 |
| 25（OH）D 3-IS-1 | 407.3 | 263.2 | 50 | 22 |
电离方式：大气压化学电离或电喷雾电离源模式，正离子。
检测方式：MRM扫描方式，母离子定量离子、定性离子和碰撞能量等参数见 附表2 。可根据实际需要进行调整。
1. 系统适用性测试：取系统适用性溶液，至少连续进样3针，3次进样结果中25(OH)D 2和25(OH)D 3的保留时间的偏差应在±0.2 min范围内，25(OH)D 2和25(OH)D 3与其内标的峰面积比值的 CV应≤15%。如系统适用性溶液测试结果不满足上述要求，可重复进样3针。
2. 样品检测：取处理好的校准品、质控品和血清样本注入高效液相色谱-串联质谱仪进行检测，记录色谱图与待测样品中25（OH）D 2、25（OH）D 3的峰面积和对应内标峰面积。
1.工作曲线的建立：分别取标准物质由低至高进行测定，每次测定均加入浓度相同的内标进行测定。以标准曲线样品的标示浓度为横坐标（ x），以标准曲线样品的实际检测峰面积与各自内标峰面积的比值为纵坐标（ y）绘制标准曲线，进行线性回归（ r 2≥0.990）。在每个分析批的前后各进行一次标准物质和质控物的检测，允许定量下限的检测浓度在靶值浓度的80.0%~120.0%，其余样品的检测浓度在靶值的85.0%~115.0%之间，标准曲线样品和质控样品浓度水平不能被移除。
公式（1）中： A std 为标准曲线样品中25(OH)D 2或25(OH)D 3定量离子MRM峰面积； A IS 为标准曲线样品中内标物MRM峰面积； C std 为标准物质的标示浓度； a为斜率； b为截距。
2. 浓度计算：根据工作曲线计算血清样本中25（OH）D 2、25（OH）D 3和25(OH)D的含量。值得注意的是，封板后的样品在2~8 ℃条件下可稳定保存2 d。
根据《WS/T 402-2012临床实验室检验项目参考区间的制定》规范，实验室可在本地建立参考区间，或者引用有完整溯源链的试剂厂家提供的参考区间进行小样本验证，每个参考区间至少选择20份样本，1个样本可以偏离已知参考区间。此外，目前可供参考的临床参考区间如 附表3 所示。
| 来源 | 正常 | 缺乏 | 不足 | 严重不足 | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| ng/ml | nmol/L | ng/ml | nmol/L | ng/ml | nmol/L | ng/ml | nmol/L | |
| WS/T 677-2020人群维生素D缺乏筛查方法 | ≥20 | ≥50 | ≥12~<20 | ≥30~<50 | <12 | <30 | - | - |
| 维生素D及其类似物临床应用共识 | >30 | >75 | 20-30 | 50-75 | <20 | <50 | <10 | <25 |
根据《GB/T 22576.1-2018/ISO 15189：2012》中的“结果发布”部分进行检测结果的报告发布，报告前可综合评估以下因素：质控是否在控，与此前结果是否一致，样本质量等因素进行综合考量。此外，建议各实验室报告单上分别显示25（OH）D 2、25（OH）D 3和25（OH）D的含量。
中国老年保健医学研究会检验医学分会, 中国老年医学学会检验医学分会. 液相色谱-串联质谱法检测25-羟维生素D标准化专家共识[J]. 中华检验医学杂志, 2021, 44(7): 587-595. DOI: 10.3760/cma.j.cn114452-20201120-00846.
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