胎儿或新生儿在围产期由于各种因素引起的缺氧缺血性脑损伤（hypoxic ischemic brain damage，HIBD）称为新生儿缺氧缺血性脑病（neonatal hypoxic ischemic encephalopathy，HIE），严重者会遗留永久性神经系统损伤，包括脑性瘫痪、智力低下、癫痫等后遗症。发达国家每1 000名活产婴儿中有1~8名发生HIE，发展中国家活产婴儿的HIE患病率约为2.6% ^{［ 1 ］} 。目前认为HIE病理生理机制为：（1）脑组织无氧代谢导致能量衰竭，神经细胞水肿、坏死；（2）缺氧导致脑血管自主调节功能紊乱，血管通透性升高导致血管源性脑水肿；（3）缺氧缺血后继发再灌注损伤，包括自由基增多、钙离子超载、氨基酸兴奋及各种细胞因子大量释放诱发的级联反应。此外，HIE患儿还可能发生代谢性酸中毒、呼吸性酸中毒等全身反应。建立HIE动物模型以最大程度地模拟HIE的病理生理过程，是研究HIE不可或缺的方法，本文从动物模型选择、建模方法、建模后评价3方面进行回顾总结，分析现有动物模型优缺点并对其研究前景进行展望。

HIBD动物模型包括啮齿类、哺乳类和灵长类动物，其中鼠应用最广泛，其次是仔猪和绵羊。鼠的脑供血结构与人类相似，且繁殖快、周期短、成本低，是研究HIE的理想动物。大型动物的大脑体积是啮齿类动物的20~50倍，与人类基因组和神经系统相似度更高，造模后的病理生理变化更接近新生儿HIE，常用模型包括胎猴产时窒息模型、胎羊脐血流阻断或脑血流阻断模型、新生仔猪严重缺氧模型和脑血流阻断模型 ^{［ 2 ］} 。也有用斑马鱼建立HIBD模型的研究，尽管斑马鱼是低等脊椎动物，生物学特性及基因调控网络与人类存在一定差异，但其神经胚形成与人类高度相似，器官结构、生理功能、发育过程也与人类相似，同时具有易饲养、对低氧敏感、繁殖力强、胚胎透明、体外发育、生长迅速等优点 ^{［ 3 ］} ；除通过向水中充入氮气制造缺氧环境外，还能使用NaN ₃溶液进行“化学”缺氧，同时也可结合转基因、显微成像、行为学检测等手段进行后续研究 ^{［ 4 , 5 ］} ，因此斑马鱼在HIBD研究领域呈现出巨大的潜力。

由于啮齿类动物在HIBD研究领域应用广泛，本研究主要介绍大鼠与小鼠的造模方法。3日龄大鼠大脑发育与胎龄23周左右早产儿相近，7日龄大鼠与32~34周早产儿相近，10~12日龄大鼠与足月儿相近。由于神经损伤的病理表现及程度与大脑发育程度密切相关，因此选择合适日龄的动物至关重要，最常用7日龄大鼠。

1.颈总动脉血流阻断合并缺氧法：Rice等 ^{［ 6 ］} 于1981年建立的HIBD新生大鼠模型（即Rice-Vannucci法）最为经典，具体操作为将7日龄大鼠麻醉后结扎切断单侧颈总动脉，术后4~8 h再将大鼠置于37℃、8%氧浓度的缺氧箱中3.5 h。脑损伤部位和性质与缺氧程度、时间密切相关 ^{［ 7 ］} ，一般8%氧浓度、缺氧时间1~2 h可达到良好造模效果 ^{［ 8 , 9 ］} 。也可用小鼠造模，但小鼠耐受性较差，造模死亡率较高，需严格把控缺氧时间。亚低温可减少缺血区神经细胞内ATP耗竭从而减轻病变程度，因此可通过降低动物体温降低死亡率。目前普遍使用的小鼠HIBD造模方法是结扎单侧颈总动脉后，将小鼠置于缺氧室（8%氧浓度，35~37℃）45~90 min ^{［ 10 , 11 ］} 。Rice-Vannucci法操作简单，重复性好、标准化程度高，并可提供不完全自身对照（未结扎侧大脑半球仅有缺氧、无缺血），同时可将鼠养大进行后期的行为学研究 ^{［ 12 ］} ；该方法不足之处在于，结扎侧大脑半球可能通过基底动脉环接受对侧供血而不能达到预期的病变程度，且永久性结扎不能模拟再灌注脑损伤的病理过程。

很多学者对Rice-Vannucci法进行了弥补和改进。有学者对4日龄大鼠进行双侧颈总动脉闭塞，然后置于8%氧浓度的缺氧仓中10 min、15 min，分别导致轻度、重度脑损伤 ^{［ 13 ］} 。也有将大鼠置于8%氧浓度的缺氧室内2 h，同时暂时阻断双侧颈总动脉30~90 min建立缺氧缺血再灌注模型，相比同等缺氧时间的Rice-Vannucci组，双侧颈总动脉夹闭60 min、90 min的大鼠脑损伤更重，再灌注后6 h、48 h的大鼠大脑皮层和海马均有缺氧缺血再灌注损伤敏感基因环氧合酶2的表达 ^{［ 14 ］} 。

有学者将Rice-Vannucci法用于转基因小鼠，造模后的铜/锌超氧化物歧化酶转基因小鼠比野生型小鼠的大脑损伤更重，提示可能是由于铜/锌超氧化物歧化酶产生过量过氧化氢加重了脑损伤，该转基因模型亦可用于探究新的治疗方法对上述转基因小鼠的神经系统保护作用 ^{［ 15 , 16 ］} 。此外，Rice-Vannucci法与转基因小鼠的结合还被用于研究缺氧缺血性脑病发病和治疗过程中离子通道的参与，如TRPM2通道 ^{［ 17 ］} 、钾离子通道 ^{［ 18 ］} 。

2.大脑中动脉闭塞法（middle cerebral artery occlusion，MCAO）：为更好地模拟缺血再灌注过程，Derugin等 ^{［ 19 ］} 采用线栓法建立了可逆性脑缺血模型，将线栓经大鼠颈外动脉-颈内动脉分岔后送入颈内动脉，再继续进入闭塞大脑中动脉，2~3 h后移除线栓以实现脑缺血再灌注。线栓法避免了开颅、缺血部位恒定，是建立MCAO模型的常用方法。此外，MCAO模型制备方法还有光化学法、微栓塞法、开颅电凝法、左侧大脑皮质血管切除法、自发性脑出血法、自体血注射法、胶原酶注射法等。目前还有一种新的可逆性MCAO技术将磁性纳米颗粒注入动物血管，引导其在血管内聚集从而阻塞血管，该方法可灵活控制缺血再灌注时间并精准控制血流，也可避免侵入性操作给动物带来的伤害 ^{［ 20 ］} 。缺氧是HIE发病的核心，上述方法只造成脑缺血而不涉及缺氧，并不能很好地模拟HIE的完整病理过程，但对于研究HIE缺血再灌注损伤有一定价值。

3.单纯缺氧法：单纯缺氧法可模拟损伤较轻的HIE病理过程，也可作为一种有效的HIBD造模法 ^{［ 12 ］} ，本文按缺氧方式及时间将其分为慢性间歇缺氧法、慢性持续缺氧法和急性缺氧法。前两种方法常用于研究周期性呼吸暂停、先天性心脏病、慢性通气障碍等疾病 ^{［ 21 ］} 。慢性间歇缺氧法采用一种程序化的氧气浓度变化模式（每次3 min缺氧+7 min空气，6次/h），将2日龄幼鼠置于这种低氧环境可导致大脑及全身性炎症，引起轴突损伤和髓鞘减少 ^{［ 22 ］} 。慢性持续缺氧法和急性缺氧法用于模拟不同程度的窒息，而急性缺氧法导致的神经病理改变明显重于慢性持续性缺氧法 ^{［ 23 ］} ，也有用血管夹夹闭7日龄大鼠气管8~14 min进行缺氧处理，术后大鼠学习记忆能力和空间定位能力明显受损，损伤早期脑组织病理改变表现为典型的HIE早期损伤改变如神经元核固缩、坏死及脑出血等，造模后3 d大鼠大脑皮层和海马神经元凋亡较对照组增加 ^{［ 24 ］} 。Nemeth等 ^{［ 25 ］} 采用低氧-高二氧化碳（6%O ₂-20%CO ₂）混合气体通气20 min建立急性缺氧模型，目的是模拟HIE的高碳酸血症。以上单纯缺氧模型具有操作简单、成功率高、可消除麻醉因素影响等优点，缺点是不同动物的缺氧耐受程度、缺氧时间、温度都对结果有很大影响 ^{［ 12 ］} 。

4.宫内窘迫法：为模拟人类胎儿宫内缺血缺氧的过程，许多学者采用宫内窘迫法，包括子宫切除的延迟剖宫产、阻断子宫动脉供血、母体缺氧等。

子宫由双侧卵巢动脉和子宫动脉供血，可用不同组合方式和阻断时间进行造模。Tashima等 ^{［ 26 ］} 结扎孕17 d大鼠双侧子宫动脉、第22天行剖宫产，造成新生鼠顶叶皮层神经元丢失，生后7 d可观察到大脑皮层分层紊乱。利用金属微圈造成母体子宫动脉狭窄是近几年建立HIBD模型的新方法，使用不同内径的微弹簧圈可改变血流灌注程度，产生比子宫动脉完全结扎更贴近临床实际情况的损伤，且可确保宫内大部分幼崽具有相似水平的血流灌注 ^{［ 27 ］} 。Bjelke等 ^{［ 28 ］} 设计了子宫切除的延迟剖宫产模型，切除孕鼠子宫后，将其置于37℃生理盐水中模拟生前急性窒息，该模型幼崽生后可出现行为和认知缺陷，包括空间和工作记忆损害 ^{［ 29 ］} 、运动协调和反射能力落后 ^{［ 30 ］} 、探索行为减少及焦虑相关行为增加 ^{［ 31 ］} 。2016年，Sparnaaij等 ^{［ 32 ］} 将上述两种模型相结合，在大鼠孕17 d夹闭子宫动脉，足月时切除子宫角进行延迟剖宫产，发现缺氧缺血预处理对胎儿窒息具有神经保护作用，但这种现象的机制和临床意义有待阐明。

母体缺氧法是将怀孕动物置于缺氧环境中一定时长，从几个小时到连续几天不等。有研究发现，母体处于缺氧状态下分娩的幼崽空间学习和记忆能力下降，无论是持续2 h的急性母体缺氧，还是持续2周的慢性母体缺氧都会导致幼崽脑细胞、分子水平的显著病理改变和行为缺陷 ^{［ 33 ］} 。

5.感染合并缺氧缺血法：感染引发的炎性因子可降低损伤阈值，增加早产儿神经系统对缺氧缺血损伤的易感性，加重损伤程度。与单独缺氧缺血相比，同时注射大肠埃希菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的7日龄大鼠神经损伤和死亡率显著升高 ^{［ 34 ］} 。此外，Eklind等 ^{［ 35 ］} 发现在缺氧缺血损伤前4 h、6 h、3 d注射LPS可显著增加大鼠脑损伤风险，而缺氧缺血性损伤前24 h注射LPS对神经系统有保护作用，这提示炎症诱导和缺氧缺血之间的时间间隔可影响神经系统损伤程度。该模型可模拟妊娠晚期宫内感染合并缺氧缺血引起的HIE，成功率高，操作简单，但制备时间较长，实验过程死亡率较高。

1.直接观察法：造模后可观察动物行为（烦躁不安、发绀、嗜睡、易激惹、固定重复动作等）判断其脑功能，也可测试其翻身、爬行能力及四肢肌张力评估神经损伤程度，常见表现还包括躯体总向一侧做旋转运动、爬行时后肢拖拽步态或头颈部震颤，这是大脑皮层下运动中枢受损引起的平衡失调。

2.行为学：造模成功2~3周后可对模型动物进行行为学评估，包括平衡木试验、足印重复间距试验，评估其运动协调和平衡能力。旷场试验是指动物在中央格的停留时间，反映认知能力，认知能力差则停留时间长 ^{［ 36 ］} ；还可用Morris水迷宫、定位航行、空间探索实验评价学习记忆能力。

3.神经反射：常用方法包括悬吊实验、翻正反射实验、负趋地性实验、Longa评分法、Grip test评分法等 ^{［ 10 ， 37 ］} ，可用于评估脑损伤程度及预测远期神经功能。

4.组织形态学：肉眼观察双侧大脑半球是否对称、脑组织是否有液化坏死，以及各部分脑组织大小和形态的变化。尼氏染色可以显示脑组织的改变，损伤可导致神经元肿胀、尼氏小体空泡形成、排列紊乱，HE染色也有相同的评估作用。TTC染色可用于评估脑梗死程度。此外，TUNEL染色、组织化学染色、GFAP免疫荧光等方法也可确定分子水平脑损伤 ^{［ 38 ］} 。组织形态学观察一般于术后7 d内进行，多选1~3 d。

5.影像学：正电子发射计算机断层扫描可用于评估HIBD动物模型基底节损伤程度 ^{［ 39 ］} ，磁共振成像可定位脑损伤部位和范围，缺氧缺血早期（1~2 h）大脑不可逆梗死范围可用扩散加权成像预测 ^{［ 40 ］} 。此外，还可通过透射电镜观察神经元细胞器和微血管的变化，用扫描电镜观察缺氧后的红细胞形态评估缺氧缺血程度 ^{［ 41 ］} 。多普勒超声也是一种具有较高价值的检测手段，有研究表明新生大鼠模型脑内血流动力学参数的改变与HIE早期病变程度相对应，声辐射力脉冲成像技术可定量反映脑组织的质地变化，评估脑损伤程度 ^{［ 42 ］} 。

6.分子生物学：可用酶联免疫吸附法和逆转录聚合酶链反应技术检测促炎细胞因子、特异性中枢神经系统酶的水平。Borjini等 ^{［ 43 ］} 用Luminex多因子液相分析技术定量检测脑脊液和血浆中的多种炎性趋化因子水平，同时用逆转录聚合酶链反应技术对缺氧缺血后脑组织Edn1、Hif1-α、Mmp9等水平进行基因表达分析揭示这些分子的变化。检测这些生化指标有助于判断造模是否成功，也有助于判断模型的损伤程度和药物的疗效。

不同造模方法侧重点不同，对于HIE病理过程的模拟度差异也很大，应根据不同研究目的选用相应的模型与评价方法，同时也需继续改进造模方法，在尽可能还原HIE病理过程的基础上，建立标准化程度高、易操作、成本低的HIBD模型。