启动子结合蛋白调节C3H10T1/2间充质干细胞的成骨机制

赵庆华; 张昭亮; 李吉鹏; 张爱华

doi:10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2014.03.020

高级检索

IP登录

登录IP

切换

退出

中华医学杂志

• 基础研究 •

ENGLISH ABSTRACT

启动子结合蛋白调节C3H10T1/2间充质干细胞的成骨机制

作者及单位信息

出版日期： 2014 -01 -21 ·

DOI： 10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2014.03.020

DNA hypermethylation at C/EBPα gene promoter relieves a PPARγ-associated repression of HDAC1

Authors Info & Affiliations

Zhao Qinghua

Department of Orthopedics, First Municipal People′s Hospital, Shanghai 200080, China

Zhang Zhaoliang

Li Jipeng

Zhang Aihua

Published： 2014 -01 -21 ·

DOI： 10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2014.03.020

619

APP内阅读

摘要

目的探究启动子结合蛋白(C/EBPα)对于间充质干细胞(MSC)C3H10T1/2细胞成骨调节的分子机制。

方法体外构建成骨分化模型，应用反向聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹检测C3H10T1/2细胞成骨分化时过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)的mRNA和蛋白质的表达；通过构建干扰PPARγ siRNA的腺病毒载体及PPARγ拮抗剂G3335，观察PPARγ对于激活C/EBPα表达的作用。色质免疫沉淀分析(ChIP)检测PPARγ2位于C/EBPα启动子－1 286 bp/－1 065 bp区域内的结合位点并检测PPARγ与C/EBPα启动子－1 286 bp/－1 065 bp区段DNA甲基化和组蛋白高度去乙酰化的关系。

结果C3H10T1/2细胞在成骨分化时，PPARγ的mRNA和蛋白质的表达呈先升高后下降的双时相反应。siRNA和G3335引起的PPARγ活性的下调抑制了C/EBPα在C3H10T1/2细胞成骨分化时的上调(对照组6.1 mg/L，罗格列酮组13.0 mg/L，罗格列酮＋G3335组11.0 mg/L, P<0.05)。DNA甲基化能减弱PPARγ2向－1 286 bp/－1 065 bp区段的结合能力。

结论C3H10T1/2细胞在成骨分化时，PPARγ通过结合至C/EBPα启动子－1 286 bp/－1 065 bp区段来促进该基因的表达，阻抑了PPARγ与之结合，与PPARγ相关的蛋白去乙酰化酶抑制得以解除，从而下调了－1 286 bp/－1 065 bp区段的组蛋白乙酰化，C/EBPα启动子促进C3H10T1/2细胞成骨过程。

关键词：骨生成;干细胞;过氧化物酶体类

ABSTRACT

ObjectiveTo explore the molecular mechanisms of C/EBPα for regulating the osteogenesis of C3H10T1/2 cells.

MethodsWe constructed an in vitro osteogenic differentiation model and investigated the mRNA and protein expression profile of PPARγ2 during C3H10T1/2 osteogenesis by reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)and Western blot. Next we constructed an adenovirus vector loading siRNA against PPARγ2 and employed a specific antagonist of PPARγ, G3335, to examine the effect of PPARγ on activating the expression of C/EBPα. Then we performed ChIP to test PPARγ2 binding on -1 286 bp/-1 065 bp region of C/EBPα promoter and explore the role of PPARγ in the dependence of histone hypoacetylation on DNA methylation in -1 286 bp/-1 065 bp region of C/EBPα promoter.

ResultsDuring the osteogenic differentiation, PPARγ mRNA and protein expression initially increased and then decreased in double-phase reactions. siRNA and G3335 induced down-regulation of PPARγ activity inhibited C/EBPα in C3H10T1/2 cells up-regulation of osteogenic differentiation. ChIP results show that DNA methylation could weaken the binding section PPARγ2 to -1 286 bp/-1 065 bp capabilities.

ConclusionThis study provides a deeper insight into the molecular mechanisms underlying the osteogenesis of MSCs regulated by C/EBPα in synergy with PPARγ. PPARγcontributes to C/EBPαexpression through binding on -1 286 bp/-1 065 bp region of its promoter during the osteogenesis of C3H10T1/2 cells. And DNA hypermethylation in-1 286 bp/-1 065 bp region during the terminal stage of osteogenesis prevents PPARγ from binding on it so that PPARγ-associated repression of HDAC1 is relieved to down-regulate the acetylation status of -1 286 bp/-1 065 bp region. Meanwhile DNA methylation and histone acetylation are linked by PPARγ for regulating the differentiation of MSCs.

KEYWORDS： Osteogenesis;Stem cells;Peroxisomes

Corresponding author: Zhao Qinghua, Email: mocdef.3ab61oahzsenobwas

NOTES:

Zhao Qinghua and Zhang Zhaoliang are the first authors who contributed equally to the article

COPYRIGHTS:

No content published by the journals of Chinese Medical Association may be reproduced or abridged without authorization. Please do not use or copy the layout and design of the journals without permission.

All articles published represent the opinions of the authors, and do not reflect the official policy of the Chinese Medical Association or the Editorial Board, unless this is clearly specified.

引用本文

赵庆华,张昭亮,李吉鹏,等. 启动子结合蛋白调节C3H10T1/2间充质干细胞的成骨机制[J]. 中华医学杂志,2014,94(3)：227-231.

DOI:10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2014.03.020

PERMISSIONS

Request permissions for this article from CCC.

评价本文

*以上评分为匿名评价

版权归中华医学会所有。

未经授权，不得转载、摘编本刊文章，不得使用本刊的版式设计。

除非特别声明，本刊刊出的所有文章不代表中华医学会和本刊编委会的观点。

在多种类型的人类疾病中，间充质干细胞(MSC)的成骨与成脂肪作用之间的平衡会受到破坏。因此，可以通过调节骨形成与脂肪形成的平衡来预防、治疗体内不正常的骨形成与过度的脂肪形成 ^{[
1
]}。基因启动子(CCAAT)结合蛋白(C/EBPα)作为一种脂肪形成的主要转录因子，具有调节C3H10T1/2型MSC成骨与成脂肪作用平衡的作用，通过表观遗传修饰(DNA甲基化与组蛋白乙酰化)来发挥重要作用 ^{[
2
]}。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)可通过移除组蛋白脱乙酰基酶(HDAC1)来降解蛋白酶体，从而激活C/EBPα的表达 ^{[
3
]}。PPARγ的结合位点(－1 240 bp/－1 223 bp)应该位于C/EBPα作用的－1 286 bp/－1 065 bp区段中。所以假设在成骨作用终末期，C/EBPα作用区域DNA甲基化阻抑了PPARγ的结合，HDAC1积累于－1 286 bp/－1 065 bp区段中，引起这个区段的组蛋白去乙酰化。为了验证这一假设，本研究观察C3H10T1/2细胞成骨时，PPARγ是如何激活C/EBPα表达以及DNA甲基化与组蛋白乙酰化调节C3H10T1/2细胞成骨作用的分子机制。

材料与方法

1．细胞培养和成骨诱导分化：

C3H10T1/2细胞保存于添加了10%胎牛血清、50 U/ml青霉素、50 g/L链霉素的DMEM培养基中(Invitrogen, Carlsbad，CA，美国)。培养基放置在37 ℃、5%CO ₂的人工环境下培养。C3H10T1/2细胞用终浓度为300 μg/L的rhBMP-2(R&D，Minneapolis，MN，美国)处理来进行成骨诱导分化。每3天更换1次培养基。

2．碱性磷酸酶(ALP)活性测定：

ALP的活性以p-硝基苯磷酸作为溶质，在405 nm波长下进行测定。将50 μl样品与50 μl p-硝基苯磷酸(1 g/L)在含有0.5 mmol/L MgCl ₂(pH 9.8)的1 mol/L二乙醇胺缓冲液中混合，在37 ℃环境下，置于摇床上混匀15 min。然后以每100 μl反应液加入25 μl的3 mol/L NaOH溶液来终止反应。使用PIERCE蛋白检测试剂盒(Rockford，IL，美国)，利用二奎磷酸法(BCA法)测定相同样本的总蛋白含量。在562 nm处读数并根据一系列的白蛋白(牛血清蛋白)标准进行计算。在实验中，ALP水平被标准化为总蛋白含量。每个实验在同一条件下均重复3次。

3．反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术检测骨桥蛋白和骨钙蛋白mRNA表达水平：

细胞RNA总量可根据试剂说明采用TRIzol分离液分离。在RNA逆转录反应后，根据ABI7900HT系统，采用SYBR ^®Premix Ex Taq™(Takara, Dalian，中国)进行RT-PCR的检测。RT-PCR按如下条件进行：94 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s为1个循环，进行40个循环。β-肌动蛋白作为成骨标记基因的内部对照。

4．免疫印迹(Western blot)PPARγ蛋白质含量：

配置加入蛋白裂解抑制剂(10 g/ml亮肽酶素，10 g/ml抑胃酶素A和10 g/ml抑肽酶)的RIPA缓冲液，将细胞与上述缓冲液于冰上裂解30 min。采用十二烷基酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)电泳分离技术将蛋白质分离并转移至硝化纤维薄膜上，并分别应用抗C/EBPα抗体(细胞信号转导技术)、抗PPARγ抗体(abcam)、抗肌动蛋白β抗体(Sigma)检测。使用增强化学发光系统(GE Healthcare Piscataway，NJ，美国)进行免疫染色。

5．扩增C/EBPα启动子区域：

5′端基因敲除突变体的构建用含有Xhol(5′)、Hind(3′)这两个酶切位点的pfu DNA聚合酶(Takara)从C3H10T1/2细胞DNA中，扩增C/EBPα基因5′调控区的1 426 bp片段(－1 381 bp/＋45 bp)。该片段被转入pGL3-Basic质粒(Promega，CharbonniErs，法国)中被复制，命名为－1 381 bp/＋45 bp片段。以－1 381 bp/＋45 bp为模板，借助PCR技术构建了若干5′截断突变体：－1 009 bp/＋45 bp，－420 bp/＋45 bp, －55 bp/＋45 bp。

6．体外甲基化检测：

包含CPG岛1的DNA片段均被限制性核酸内切酶切除，并经过凝胶电泳纯化后，使用CPG甲基化试剂盒(M.SssI每克DNA加入2 U，在37 ℃下孵育6 h)使得所有CPG岛位点甲基化。随后将M.SssI在65 ℃下保温15 min做失活处理。处理过的DNA片段与载体进行连接，之后用酚氯仿纯化并用乙醇沉淀。质粒的浓度通过 A260来检测。

7．真核生物功能质粒的构建：

pcDNA3.1(＋)质粒中包含有特殊的Kpnl和Xbal位点，将编码鼠PPARγ2的序列插入其间。构建体的引物序列为：5′ATGGTACCATGGGTGAAACTCTGGGAGAT3′(＋)，5′CATTCTAGACTAATACAAGTCCTTGTAGAT3′(－)。显性负激活PPARγ2表达载体(PPARγ2-DN)是由pcDNA3.1(＋)-PPARγ经历了体外PPARγ编码区L496A位点的突变后构建而成。所有的功能质粒都经过了测序，且其各种过度表达的蛋白质也通过即时转染入人293T细胞和随后的免疫印迹分析得以验证。

8．染色质免疫沉淀作用分析：

细胞在37 ℃下与1%甲醛溶液混合10 min。之后用冷磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，放置于SDS裂解缓冲液中，超声处理至DNA片段大小为300～400 bp。再加入抗乙酰组蛋白3，4抗体(Upstate, New York, NY，美国)，抗HDAC1抗体和抗PPARγ抗体(abcam)。4 ℃过夜孵养后，用鱼精蛋白/DNA与50%琼脂糖混合浆(Santa Cruz, CA，美国)收集免疫复合物，约2 h，随后充分冲洗。得到的样品再用洗脱缓冲液(1%SDS，0.1 mol/L NaHCO ₃)抽提，加热至65 ℃过夜解除交联。DNA纯化并采用PCR技术检测。用于染色质免疫沉淀的引物组为：引物组A 5′GAGACGTGGGTGCTCACC3′(＋)；5′TTCTTTCCCTA-CTGTCATTCA3′(－)引物组B5′GAGACGTGGGTG-CTCACC3′(＋); 5′ATCGACTGTGCCGTAATCT3′(－)。

9．统计学分析：

应用SPSS 10.0进行所有数据的分析，数据用 M± s表示，用单因素方差分析( ANOVA)和 Student T检验分析组间数据的统计学关系， P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1．C3H10T1/2细胞骨化过程中PPARγ2参与C/EBPα的表达活化：

将融合的C3H10T1/2细胞暴露于300 μg/L浓度的rhBMP2中建造体外成骨分化模型。BMP2治疗下，可观察到ALP活性显著升高。定量PCR的结果显示在BMP2处理后第14、21天，骨桥蛋白(OPN)和骨钙蛋白(OC)mRNA的表达水平以及成骨分化中期和末期的标记基因显著上调( 图1 )。PPARγ的mRNA含量水平呈双时相反应，即含量在第3～14天增加，在14 d达到最大水平，直到第21天才逐渐回落( 图1 )。

图1 C3H10T1/2细胞成骨分化过程中，BMP2，G3335和Adv-si-PPARγ2影响下的C/EBPα启动子mRNA表达情况

免疫印迹的结果显示了PPARγ蛋白质含量与mRNA含量具有同样的变化模式。PCR结果显示，siRNA和G3335引起的PPARγ活性的下调抑制了C/EBPα在C3H10T1/2细胞成骨分化时的上调。在C3H10T1/2细胞成骨分化时，PPARγ对于激活C/EBPα的活性的作用相同。2 h C/EBPα mRNA含量：对照组5.2 mg/L，罗格列酮组11.8 mg/L，罗格列酮＋G3335组10.1 mg/L；4 h C/EBPα mRNA含量：对照组6.1 mg/L，罗格列酮组12.4 mg/L，罗格列酮＋G335组10.8 mg/L；8 h C/EBPα mRNA含量：对照组6.1 mg/L，罗格列酮组13.0 mg/L，罗格列酮＋G3335组11.0 mg/L( 图2 )。

图2 PPARγ2插入C/EBPα启动子－1 286/－1 065 bp区段并激活其表达情况

2．PPARγ2结合于－1 286/－1 065 bp启动子区域激活C/EBPα的表达：

得到3个基因敲除片段，－1 009 bp/＋45 bp, －420 bp/＋45 bp, －55 bp/＋45 bp。不同的C/EBPα启动子片段分别被转入pGL3-Basic质粒( 图3 )。BMP2和罗格列酮处理后，－1 381 bp/＋45 bp区段的启动子活性显著升高，但－1 009 bp/＋45 bp区段的活性变化不明显。使C/EBPα启动子对BMP2和罗格列酮起效应的关键区域位于C/EBPα启动子的－1 381 bp/－1 009 bp区段内。

图3 C/EBPα启动子－1286/－1065 bp区段超甲基化对与PPARγ相关的HDAC1阻滞作用的解除。A.体外甲基化处理和非甲基化处理的CpG岛1启动子荧光酶素载体图像。B.在罗格列酮和BMP2影响下，PPARγ2在C/EBPα启动子－1286/－1065 bp甲基化和非甲基化区段结合情况

构建的过度表达的野生型PPARγ2基因(PPARγ2-WT)和显性负激活PPARγ2基因(PPARγ2- DN)的质粒载体，与－1 381 bp/＋45 bp，－1 009 bp/＋45 bp，－420 bp/＋45 bp, －55 bp/＋45 bp片段共转染至C3H10T1/2细胞内显示，PPARγ2-WT能显著提升－1 381 bp/＋45 bp片段启动子的活性，但对－1 009 bp/＋45 bp片段的启动子活性影响不明显。相比，PPARγ2-DN减弱了－1 381 bp/＋45 bp片段活性，而对－1 009 bp/＋45 bp片段活性影响不明显，在C/EBPα启动子－1 381 bp/－1 009 bp区域内可能存在PPARγ2的结合位点。

3．C/EBPα启动子－1 286 bp/－1 065 bp区域的DNA甲基化解除与PPARγ激活相关HDAC1的抑制：

染色质免疫沉淀分析(ChIP)检测PPARγ2位于C/EBPα启动子－1 286 bp/－1 065 bp区域内的结合位点。在成骨分化终末期PPARγ2的结合力弱于分化早期。5′-aza可引起DNA去甲基化，从而恢复该区域PPARγ2的结合能力。在C3H10T1/2细胞成骨分化终末期，C/EBPα启动子－1 286 bp/－1 065 bp区域的DNA甲基化能阻断PPARγ2的结合。在体外将－1 286 bp/－1 065 bp区段甲基化，将载体转染至C3H10T1/2细胞内，并在经BMP2或罗格列酮处理后进行染色质免疫沉淀分析显示DNA甲基化能减弱PPARγ2向－1 286 bp/－1 065 bp区段的结合能力。

在C3H10T1/2细胞成骨分化的终末期(21 d)C/EBPα启动子－1 286 bp/－1 065 bp区段的组蛋白3、4发生去乙酰化。C/EBPα启动子区域的组蛋白3、4去乙酰化水平在一定程度上取决于DNA甲基化的水平。PPARγ可通过移除组蛋白脱乙酰基酶(HDAC1)来降解蛋白酶体，从而激活C/EBPα的表达。在C3H10T1/2细胞成骨分化早期(3 d)和终末期(21 d)时，同成骨分化早期相比，分化终末期的组蛋白3、4去乙酰化被阻抑，而HDAC1在C/EBPα启动子－1 286 bp/－1 065 bp区段的结合能力明显增强。5′-aza可将HDAC1从C/EBPα启动子－1 286 bp/－1 065 bp区段移除，引起此段组蛋白3、4高度去乙酰化。

在BMP2诱导3 d后，C/EBPα启动子－1 286 bp/－1 065 bp区段内，PPARγ2-WT和PPARγ2-DN的过度表达情况显示，HDAC结合能力和组蛋白3、4去乙酰化水平。PPARγ2-DN对于HDAC1结合能力的增强及组蛋白3、4去乙酰化的阻滞作用明显强于PPARγ2-WT。在BMP2和5′-aza诱导21 d后，可见类似的结果。

讨论

对间充质干细胞成骨分化的探究可帮助阐明MSC成骨分化的机制，也对治疗一些以骨质缺失为特点的疾病有重要作用。小鼠爬坡试验促进成骨分化中，PPARγ2和C/EBPα mRNAs的表达含量显著高于对照组 ^{[
4
]}。C/EBPα能诱导C2C12成肌细胞分化成为成脂细胞和成骨细胞，并且成骨细胞的形成是在C/EBPα较低水平时而脂肪细胞特异性分化需要较高的C/EBPα表达 ^{[
5
]}。Fan等 ^{[
2
]}的研究进一步提供证据表明C/EBPα能够调节间充质干细胞成骨和成脂分化之间的平衡，其中涉及C/EBPα启动子－1 381 bp/－1 009 bp区域内显著的DNA甲基化和组蛋白3、4去乙酰化。本研究进一步验证了在C3H10T1/2细胞成骨分化时，PPARγ可通过结合C/EBPα启动子－1 286 bp/－1 065 bp区域来激活C/EBPα的表达，这意味着PPARγ可能成为另一个调节间充质干细胞成骨和成脂分化之间平衡的靶点。

本研究显示位于－1 286 bp/－1 065 bp的C/EBPα启动子区域内假定的PPARγ结合位点。因此推测在C3H10T1/2细胞成骨分化时，PPARγ对于C/EBPα具有激活作用。为了验证这一假设，我们首先构建了承载干扰PPARγ的siRNA的腺病毒载体并感染C3H10T1/2细胞，使得PPARγ表达下调。除此载体外，还使用了特异的PPARγ拮抗剂G3335来阻滞其活性，结果显示在C3H10T1/2细胞成骨分化时，PPARγ对于激活C/EBPα的活性至少起了一部分作用。本研究也观察到了PPARγ与结合于C/EBPα启动子－1 286 bp/－1 065 bp区段的HDAC1相拮抗，即PPARγ可将HDAC1从C/EBPα启动子－1 286 bp/－1 065 bp区段移除。

CpG区域甲基化、染色体结构和基因沉默是相互关联的。在体外，启动子序列的甲基化可抑制基因效应。CpG岛的甲基化能引起稳定的遗传转录沉默，其通过甲基-DNA特异蛋白结合于相应CpG岛来吸引组蛋白修饰酶，在局部形成一个染色质沉默状态。目前的研究结果表明，C/EBPα启动子－1 286 bp/－1 065 bp区域的DNA甲基化和组蛋白3、4的去乙酰化是由PPARγ相联系的，即－1 286 bp/－1 065 bp区域的DNA甲基化阻滞了PPARγ结合该区域，因此PPARγ相关的HDAC1抑制得到缓解，HDAC1可结合到－1 286 bp/－1 065 bp区域下调组蛋白的乙酰化水平。

如果运用原代间充质干细胞探寻MSCs在PPARγ、C/EBPα和表观遗传修饰等调节因素下的成骨分化的分子机制，取得的实验数据相对于细胞系来说无疑更接近体内的环境。但是有时候用原代细胞去研究表观遗传学会有相当的困难，因为原代细胞一旦脱离体内环境而在体外培养，遗传学状态往往会发生较大的变化。本实验构建的体外细胞模型为成骨分化模型，如构造更加系统的体外细胞模型，包括成骨、成脂肪共分化模型，可能获得关于动物表观遗传修饰的更多信息。

摘要
材料与方法
结果
讨论
参考文献

参考文献

[1]

Nuttall ME , Gimble JM . Is there a therapeutic opportunity to either prevent or treat osteopenic disorders by inhibiting marrow adipogenesis[J]？Bone, 2000,27:177–184.

返回引文位置Google Scholar

百度学术

万方数据

[2]

Fan Q , Tang T , Zhang X ,et al. The role of CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP)-alpha in osteogenesis of C3H10T1/2 cells induced by BMP-2[J]. J Cell Mol Med, 2009,13:2489–2505.

返回引文位置Google Scholar

百度学术

万方数据

[3]

Zuo Y , Qiang L , Farmer SR . Activation of CCAAT/enhancer-binding protein (C/EBP) alpha expression by C/EBP beta during adipogenesis requires a peroxisome proliferator-activated receptor-gamma-associated repression of HDAC1 at the C/ebp alpha gene promoter[J]. J Biol Chem, 2006,281:7960–7967.

返回引文位置Google Scholar

百度学术

万方数据

[4]

Kunitaka M , Mori L . Climbing exercise enhances osteoblast differentiation and inhibits adipogenic differentiation with high expression of PTH/PTHrP receptor in bone marrow cells[J]. Bone, 2008,43:613–620.

返回引文位置Google Scholar

百度学术

万方数据

[5]

Fux C , Mitta B , Kramer BP ,et al. Dual-regulated expression of C/EBP-alpha and BMP-2 enables differential differentiation of C2C12 cells into adipocytes and osteoblasts[J]. Nucleic Acids Res, 2004,32:e1.

返回引文位置Google Scholar

百度学术

万方数据

备注信息

通信作者：赵庆华，Email： mocdef.3ab61oahzsenobwas

赵庆华、张昭亮对本文有共同贡献，并列为第一作者

评论 （0条）

暂无评论，发表第一条评论抢沙发