高级检索
中国临床解剖学杂志
期刊首页
过刊列表
高级检索
稿件发表
• 实验研究 •
ENGLISH ABSTRACT
肌肽通过激活Nrf2/ARE信号通路改善OGD/R诱导星形胶质细胞损伤
于露
罗杰斯
任毅
赵艳
杨文强
杨新霞
杨菁
作者及单位信息
·
DOI： 10.13418/j.issn.1001-165x.2023.3.11
Carnosine protects OGD/R-induced astrocyte injury via Nrf2/ARE signaling pathway
YU Lu
Odhiambo Ndolo Rodgers
REN Yi
ZHAO Yan
YANG Wen-qiang
YANG Xin-xia
YANG Jing
Authors Info & Affiliations
YU Lu
Department of Biochemistry and Molecular Biology, Basic Medical College, Jinzhou Medical University, Jinzhou 121001, China
Odhiambo Ndolo Rodgers
Department of Biochemistry and Molecular Biology, Basic Medical College, Jinzhou Medical University, Jinzhou 121001, China
REN Yi
Department of Biochemistry and Molecular Biology, Basic Medical College, Jinzhou Medical University, Jinzhou 121001, China
ZHAO Yan
Department of Biochemistry and Molecular Biology, Basic Medical College, Jinzhou Medical University, Jinzhou 121001, China
YANG Wen-qiang
Department of Biochemistry and Molecular Biology, Basic Medical College, Jinzhou Medical University, Jinzhou 121001, China
YANG Xin-xia
Department of Biochemistry and Molecular Biology, Basic Medical College, Jinzhou Medical University, Jinzhou 121001, China
YANG Jing
Department of Biochemistry and Molecular Biology, Basic Medical College, Jinzhou Medical University, Jinzhou 121001, China
·
DOI： 10.13418/j.issn.1001-165x.2023.3.11
0
0
0
0
0
0
PDF下载
APP内阅读
摘要

目的探讨肌肽对缺糖缺氧/复糖复氧（OGD/R）引起星形胶质细胞（astrocyte，AS）损伤的保护作用，并阐明其机制。

方法分离新生24 h SD大鼠大脑皮质，培养并纯化AS后，随机分为对照组、模型组、OGD/R+肌肽组（1、3、9 mmol/L）。倒置显微镜观察细胞形态；免疫荧光GFAP染色法测定细胞纯度；噻唑蓝（MTT）法检测细胞存活率；比色法检测乳酸脱氢酶（LDH）的漏出率；Hoechst 33258染色法检测细胞凋亡；流式细胞仪检测细胞内活性氧（ROS）含量；免疫荧光检测Phospho-Nrf2(S40)的入核水平；Western blotting法检测Nrf2总蛋白以及Phospho-Nrf2(S40）蛋白表达；qPCR法检测HO-1、NQO1 mRNA含量。

结果与对照组相比，模型组细胞活力明显降低（ P<0.01），LDH漏出及细胞凋亡率显著增加（ P< 0.01），细胞内ROS生成明显增加（ P<0.01），AS核内Phospho-Nrf2(S40）含量及其下游产物HO-1、NQO1 mRNA表达量下调（ P<0.01）。与模型组相比，OGD/R+肌肽组（1、3、9 mmol/L）细胞活力明显升高（ P< 0.01），LDH漏出及细胞凋亡率降低（ P<0.01），细胞内ROS生成不同程度减低（ P<0.01），AS核内Phospho-Nrf2(S40）含量及其下游产物HO-1、NQO1 mRNA表达量上调（ P<0.01）。

结论肌肽可通过抑制OGD/R诱导ROS释放，激活Nrf2-ARE通路，进而增强其下游抗氧化酶HO-1、NQO1 mRNA的表达，对AS发挥保护作用。

肌肽;缺糖缺氧/复糖复氧;星形胶质细胞;氧化应激;Nrf2
ABSTRACT

ObjectiveTo investigate the protective effect of carnosine on OGD/R-induced astrocyte injury and its mechanism.

MethodsThe cerebral cortex of neonatal 24-hour SD rats was isolated, cultured, and purified. Astrocytes were randomly divided into control group, OGD/R group, and OGD/R+carnosine group (1, 3, 9 mmol/L). The morphological changes of cells were observed by inverted microscope. The cell survival rate was detected by MTT assay. Lactate dehydrogenase (LDH) detection kit was used to detect the leakage of LDH. Apoptosis was detected by Hoechst 33258 staining. The content of reactive oxygen species (ROS) in cells was detected by flow cytometry. The nuclear entry level of Phospho-Nrf2(S40) was detected by immunofluorescence. The expression of Nrf2 total protein and Phospho-Nrf2(S40) protein was detected by Western blot. The mRNA contents of HO-1 and NQO1 were detected by qPCR.

ResultsCompared with the control group, the cell viability of OGD/R group was significantly decreased ( P<0.01), LDH leakage, apoptosis rate and intracellular ROS production were significantly increased ( P<0.01). The expression levels of Phospho-Nrf2(S40) content and its downstream products HO-1 and NQO1 mRNA were down-regulated( P< 0.01). Compared with OGD/R group, OGD/R+carnosine group (1, 3, 9 mmol/L) significantly increased cell viability ( P<0.01), decreased LDH leakage, cell apoptosis and intracellular ROS production ( P<0.01). The content of Phospho-Nrf2(S40) and its downstream products HO-1 and NQO1 mRNA were up-regulated ( P< 0.01).

ConclusionsCarnosine may protect OGD/R induced AS injury via inhibiting the release of ROS, activating Nrf2-ARE pathway, and then enhancing the expression of downstream antioxidant enzymes HO-1 and NQO1.

Carnosine;OGD/R;Astrocytes;Oxidative stress;Nrf2
Zhao Yan, E-mail: mocdef.3ab6137nayoahz;
Yang Jing, E-mail: nc.defudabe.umzjgnijgnay
引用本文

于露,罗杰斯,任毅,等. 肌肽通过激活Nrf2/ARE信号通路改善OGD/R诱导星形胶质细胞损伤[J]. 中国临床解剖学杂志,2023,41(03)：310-317,323.

DOI:10.13418/j.issn.1001-165x.2023.3.11

PERMISSIONS

Request permissions for this article from CCC.

评价本文
*以上评分为匿名评价
脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI）临床表现多样，病理过程复杂，氧化应激在其中发挥重要作用。星形胶质细胞（astrocyte，AS）不仅可以释放神经递质与神经活性肽，影响突触活性，维持突触稳定，对神经元具有支持和营养作用 [ 1 , 2 , 3 ]，还在抗氧化防御中起到至关重要的作用，其功能障碍将会导致一系列神经系统变性疾病 [ 4 , 5 , 6 ]。肌肽（carnosine，CAR）是由β-丙氨酸和L-组氨酸组成的二肽，存在骨骼肌、脑和心中，被认为是一种亲水性抗氧化剂，可抵御氧化损伤，对缺血损伤的神经细胞具有保护作用。前期研究表明肌肽对大鼠缺血再灌注引起的认知功能障碍具有保护作用 [ 7 ]；肌肽还可抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）引起AS炎症因子白细胞介素1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）释放，其机制可能与肌肽抑制AS的活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成，进而抑制核转录因子кB p65（nuclear transcription factor-кB p65，NF-кB p65）激活有关 [ 8 ]。在此研究基础上，通过建立缺糖缺氧/复糖复氧（oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）AS模型，探讨肌肽通过激活核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）/抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE）信号通路减轻AS氧糖剥夺损伤，为其临床应用提供理论基础和实验依据。
1　材料与方法
1.1　主要实验材料
1.1.1　实验动物
由锦州医科大学实验动物中心提供健康新生24 h内的Sprague-Dawley（SD）大鼠，不限雌雄，已通过实验动物伦理审查，编号：2020101501；实验动物使用许可证编号：SYXK（辽）2019-0007。
1.1.2　主要实验药品与试剂
肌肽由苏州富士莱医药股份有限公司惠赠，批号：2104282，纯度≥99.9%；Advanced DMEM/F-12培养液购自GIBCO公司；DMEM/F12无糖基础培养液购自武汉普诺赛生命科技有限公司；新生牛血清（FBS）购自浙江天杭生物科技股份有限公司；活性氧ROS检测试剂盒、噻唑蓝（MTT）、乳酸脱氢酶毒性检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；RNA isolater裂解液、qPCR试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；GFAP抗体购自Biolegend公司；Nrf2抗体购自美国Cell Signaling公司；Phospho-Nrf2(S40）兔多克隆抗体购自上海爱必信生物科技有限公司；β-actin抗体购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；HRP辣根酶标记山羊抗兔IgG二抗、HRP辣根酶标记山羊抗鼠IgG二抗、FITC标记山羊抗兔IgG二抗、TRITC标记山羊抗兔IgG二抗购自EARTHOX公司。
1.1.3　仪器设备
生物安全柜（中国海尔生物医疗公司）；CO 2培养箱、3气低氧培养箱（中国赛默飞世尔科技有限公司）；倒置生物显微镜（ZEISS公司）；荧光倒置显微镜、激光共聚焦显微镜（德国LEICA公司）；多功能酶标仪（美国BIOTEK公司）；流式细胞仪（美国BD公司）；实时荧光定量PCR仪（美国THERMO公司）。
1.2　实验方法
1.2.1　大鼠大脑皮层AS的原代分离培养
取新生24 h内的SD大鼠双侧大脑皮质。将其剪成1 mm 3大小，加入约2倍组织体积的胰酶细胞消化液，缓缓吹打混匀转移至15 mL离心管中，于37℃培养箱中消化10 min。加入与胰酶等体积的完全培养液终止消化。用200目滤网过滤组织液，800×g离心5 min，弃上清，再加入2 mL完全培养液，吹悬细胞。接种至25 cm 2培养瓶中，补入3 mL完全培养液，置37 ℃、5% CO 2培养箱培养。4 h后，收集上层未贴壁细胞悬液，加入新培养瓶中培养。第2 d换液1次，之后每3 d换液1次。细胞增殖至培养瓶底80%左右进行传代处理，传至第3代，进行后续试验。
1.2.2　AS纯度鉴定
用倒置显微镜观察细胞基本形态结构、贴壁情况及生长状态进行形态学鉴定。然后进行免疫荧光染色鉴定，步骤如下。待第3代细胞增殖至培养瓶底80%左右时，将细胞接种于预先包被有多聚赖氨酸的24孔板中，调整密度为1×10 4个/孔。细胞稳定贴壁后，室温下用4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次，5 min/次。冰上用通透液（含0.5% Triton X-100、2 mg/mL BSA的PBS）通透15 min。室温下用封闭液（含0.02% Triton-X-100、3% BSA的PBS）封闭30 min，加入GFAP一抗（1：100）冰盒4℃放置过夜。第2 d，吸除一抗，封闭液洗4次，5 min/次。加入TRITC标记山羊抗兔IgG二抗（1: 100），室温避光孵育2 h，封闭液洗3次，5 min/次。避光DAPI染核10 min，封闭液洗3次，5 min/次。免疫荧光显微镜下观察染色结果，AS细胞GFAP阳性，显红色荧光；DAPI染核，呈蓝色；随机选取不同视野的照片，分别计数GFAP阳性细胞数和DAPI阳性细胞数，其比例即为AS占所培养细胞的比例。
1.2.3　实验分组及氧糖剥夺损伤模型建立
取第3代AS，待细胞增殖至培养瓶底80%左右时，移除完全培养基（含10%FBS+1%青霉素-链霉素溶液的DMEM/F-12），用基础培养基（含0.5% FBS+1%青霉素-链霉素溶液的DMEM/F-12）冲洗细胞3遍后，将细胞随机分为对照组（Con组）、模型组（OGD/R组）、OGD/R+ CAR组（1、3、9 mmol/L）。加入基础培养基培养12 h进行血清饥饿处理。血清饥饿结束前1 h，OGD/R+ CAR组（1、3、9 mmol/L）培养基加入相应终浓度的肌肽。血清饥饿结束后，OGD/R组、OGD/R+CAR组（1，3，9 mmol/L）分别更换含有0、1、3、9 mmol/L肌肽及1%青霉素-链霉素溶液的DMEM/F12无血清无糖培养液，放置于3气低氧培养箱（95% N2、5% CO 2）37 ℃培养6 h，然后相对应更换为含有0、1、3、9 mmol/L肌肽的完全培养基常规培养24 h。
1.2.4　噻唑蓝（MTT）检测细胞存活率
取第3代AS，以5×10 3个/孔的密度接种于96孔培养板内，按1.2.3中的实验分组给予相应处理。复氧结束后，避光弃上清，在每个孔中加入20 μL的MTT(5 mg/mL）溶液与80 μL无血清培养液混合液，置37 ℃、5% CO 2培养箱培养4 h。弃上清，每个孔加入150 μL的DMSO，于多功能酶标仪上自动振板并检测490 nm的OD值。以不含细胞的孔调零，以对照组细胞的存活率为100%，细胞存活率%＝（实验组OD值-空白对照组OD值）/（对照组OD值-空白对照组OD值）×100%。实验重复3次，并设6个复孔，取平均值为最终结果。
1.2.5　比色法检测乳酸脱氢酶（LDH）漏出率
取第3代AS，以5×10 3个/孔的密度接种于96孔培养板内，按1.2.3中的实验分组给予相应处理。复氧结束后，严格按乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒步骤操作，在490 nm处测定吸光度。计算测得的各组吸光度均相应减去背景空白对照孔吸光度，细胞毒性（%）＝（处理样品吸光度-样品对照孔吸光度）/（细胞最大酶活性的吸光度-样品对照孔吸光度）×100%。
1.2.6　Hoechst 33258染色法检测AS凋亡
取第3代AS，以1×10 4个/孔的密度接种于24孔培养板内，按1.2.3中的实验分组给予相应处理。复氧结束后，弃去原培养液，用PBS清洗3次，3 min/次。室温下用4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次，3 min/次。每孔加入500 μL 10 mg/L Hoechst33258染液，37 ℃避光染色30 min，PBS清洗3次，3 min/次，荧光显微镜下观察并拍照。
1.2.7　流式细胞仪检测AS中ROS水平
取第3代AS，以2×10 5个/孔的密度接种于6孔培养板内，按1.2.3中的实验分组给予相应处理。复氧结束后，弃去培养基，避光加入按1：1000用不含血清的DMEM/F-12培养液稀释的DCFH-DA探针，于37 ℃、5% CO 2培养箱培养25 min。所有孔收集细胞至15 mL离心管，800×g离心3 min。避光弃上清，每管加入3 mL PBS重悬细胞，800×g再次离心3 min。避光弃上清，每管加入500 μL PBS重悬，并转移到流式管内使用流式细胞仪进行检测，488 nm激发波长，525 nm发射波长。
1.2.8　免疫荧光细胞化学染色检测AS中Phospho-Nrf2(S40）表达
取第3代AS，以1×10 4个/孔的密度接种于24孔培养板内，按1.2.3中的实验分组给予相应处理。复氧结束后，室温下4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次，5 min/次。冰上用通透液通透15 min。室温下用封闭液封闭30 min，加入Phospho-Nrf2(S40)一抗（1: 100）冰盒4 ℃放置过夜。第2 d，吸除一抗，封闭液洗4次，5 min/次。加入FITC标记山羊抗兔IgG二抗（1: 100），室温避光孵育2 h，封闭液洗3次，5 min/次。避光DAPI染核10 min，封闭液洗3次，5 min/次。免疫荧光显微镜下观察染色结果。
1.2.9　Western blotting法检测AS中Phospho-Nrf2(S40)、总Nrf2蛋白表达
取第3代AS，以1×10 6个/孔的密度接种于100 mm细胞培养皿内，按1.2.3中的实验分组给予相应处理。复氧结束后，取出培养皿，用细胞刮刀收集各组细胞，并于冰上裂解（裂解液按照RIPA：PMSF=100：1浓度配制）收样。BCA法对蛋白定量，常规Western blotting法检测Phospho-Nrf2(S40)、总Nrf2蛋白量，以β-actin作为内参照进行分析。
1.2.10　qPCR法检测AS中HO-1、NQO1 mRNA表达
取第3代AS，按1.2.3中的实验分组，给予相应处理。复氧结束后，采用Trizol法提取各处理组细胞总RNA，并检测其浓度。严格按照反转录试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA，进行qPCR扩增。β-actin、血红素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）及醌氧化还原酶1（NAD(P)Hquinoneoxidoreductasel，NQO1）扩增引物购自博迈德生物基因技术有限公司。引物如下：β-actin上游CACTATCGGCAATGAGCGGTTCC，β-actin下游CAGCACTGTGTTGGCATAGAGGTC；HO-1上游GCCTCCTTGTACCATATCTATA，HO-1下游GTCATCTCCAGAGTGTTCAT；NQO1上游CG AATCTGACCTCTATGCTAT，NQO1下游GGCGAA TCCTGCTACAAG。反应结束后确认实时荧光定量PCR的扩增曲线和融解曲线，以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法计算HO-1及NQO1的mRNA相对表达量。
1.3　统计学分析
采用SPSS26.0软件对数据进行分析。计量资料以均数±标准差（ ± s）表示，数据之间的比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），以 P<0.01认为有显著差异。
2　结果
2.1　AS纯度鉴定
胶质原纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）为AS骨架蛋白，常用于检测AS细胞纯度。在预实验对培养细胞进行1、2、4 h差速贴壁培养，结果发现4 h差速除掉杂细胞后培养细胞纯度效果最好，与文献中AS形态最为相符 [ 9 , 10 ]，遂选择对4 h差速培养细胞进行鉴定。带有红色荧光的细胞为GFAP标记的AS，带有蓝色荧光的则为所有具有完整细胞核的细胞，两图经Merge处理，计算GFAP与DAPI共同标记的大鼠大脑皮质AS所占比例>99%，符合实验要求。后续实验均采用4 h差速培养细胞（ 图1 ）。
GFAP鉴定培养星形胶质细胞　标尺＝100 μm
GFAP immunofluorescence staining of cultured astrocytes　bar=100 μm
2.2　肌肽对OGD/R诱导损伤AS形态学影响
倒置相差显微镜下观察AS形态学特征，对照组细胞分布均匀，胞突丰富且较长，分枝多并相互交织成网，连接紧密，细胞形状不规则，光泽度较好。与对照组相比，模型组细胞形态出现异常，表现为胞体皱缩，脱落细胞增多，出现细胞碎片，光泽度降低；与模型组相比，OGD/R+CAR（1、3、9 mmol/L）组细胞形态均有不同程度改善，且肌肽浓度越高改善效果越明显（ 图2 ）。
培养星形胶质细胞形态学观察　标尺＝100 μm

A ：对照组　 B ：模型组　 C ：OGD/R+CAR组（1 mmol/L）　 D ：OGD/R+CAR组（3 mmol/L）　 E ：OGD/R+CAR组（9 mmol/L）

Morphological observation of cultured astrocytes　bar=100 μm

A: Control group; B: OGD/R group； C: OGD/R +CAR group (1mmol/L)； D: OGD/R+ CAR group (3mmol/L); E: OGD/R+ CAR group (9mmol/L)

2.3　肌肽对OGD/R诱导损伤AS存活率影响
采用MTT法检测AS存活率，结果表明，与对照组相比，模型组细胞的存活率显著降低，差异有统计学意义（ P<0.01）；与模型组相比，OGD/R+CAR（1、3、9 mmol/L）组细胞存活率升高，且肌肽浓度越高存活率升高越明显，差异均有统计学意义（ P<0.01， 图3 ）。
肌肽对OGD/R诱导损伤后AS存活率影响

** P<0.01，与对照组比较　 ## P<0.01，与模型组比较

The effect of carnosine on the survival rate of AS after OGD/R-induced injury

** P<0.01 vs Control group; ## P<0.01 vs OGD/R group

2.4　肌肽对OGD/R诱导损伤AS细胞毒性影响
采用比色法检测AS的LDH变化，与对照组相比，模型组LDH漏出率显著增高，差异有统计学意义（ P<0.01）；与模型组相比，OGD/R+CAR（1、3、9 mmol/L）组细胞LDH漏出率减少，差异均有统计学意义（ P< 0.01），且改善程度对肌肽浓度有一定的依赖性（ 图4 ）。
肌肽对OGD/R诱导损伤AS细胞毒性影响

** P<0.01，与对照组比较　 ## P<0.01，与模型组比较

The effect of carnosine on AS cytotoxicity after OGD/R-induced injury

** P<0.01 vs Control group; ## P<0.01 vs OGD/R group

2.5　肌肽对OGD/R损伤AS凋亡影响
Hoechst33258染色荧光显微镜下观察，正常细胞呈淡蓝色、染色质均匀的椭圆形，而凋亡细胞体积变小核固缩现象明显、荧光信号量度增强，呈浓密的亮蓝色。对照组、模型组凋亡率分别为（1.6±1.7）%、（53.0±4.8）%，与对照组相比，模型组凋亡率明显升高，差异有统计学意义（ P<0.01）；与模型组相比，OGD/R+CAR(1、3、9 mmol/L）组细胞凋亡率有不同程度降低，分别为（36.3±2.7）%、（18.5±1.4）%、（4.0±2.5）%，差异均有统计学意义（ P<0.01），且随着肌肽浓度增加凋亡率降低更为明显（ 图5 ）。
肌肽对OGD/R诱导损伤后AS凋亡影响
The effect of carnosine on AS apoptosis after OGD/R-induced injury
2.6　肌肽对OGD/R诱导损伤后AS中ROS水平影响
采用流式细胞仪DCFH-DA荧光探针法检测AS内ROS水平。与对照组相比，模型组ROS水平显著增加，差异有统计学意义（ P<0.01）；与模型组相比，OGD/R+CAR(1、3、9 mmol/L）组ROS水平有不同程度降低，差异均有统计学意义（ P<0.01），且随着肌肽浓度增加ROS水平降低更为明显（ 图6 ）。
肌肽对OGD/R诱导损伤后AS中ROS水平影响

A ：对照组　 B ：模型组　 C ：OGD/R+CAR组（1 mmol/L）　 D ：OGD/R+CAR组（3 mmol/L）　 E ：OGD/R+CAR组（9 mmol/L）　 F ：ROS水平统计量化图　** P<0.01，与对照组比较　 ## P<0.01，与模型组比较

The effect of carnosine on ROS levels in AS after OGD/R-induced injury

A: Control group; B: OGD/R group； C: OGD/R +CAR group (1mmol/L)； D: OGD/R+ CAR group (3mmol/L); E: OGD/R+ CAR group (9mmol/L); F ：Statistical quantification diagram of ROS level　** P<0.01 vs Control group; ## P<0.01 vs OGD/R group

2.7　肌肽对OGD/R诱导损伤AS核内Phospho-Nrf2(S40）表达量影响
采用免疫荧光细胞化学染色法检测AS核内Phospho-Nrf2(S40）的表达，对照组、模型组的Phospho-Nrf2(S40）表达量分别为（22.4±2.5）%、（9.2±3.0）%，与对照组相比，模型组Phospho-Nrf2(S40）表达量降低。与模型组相比，OGD/R+CAR（1、3、9 mmol/L）组细胞Phospho-Nrf2(S40）表达量均增加，分别为（42.0± 2.2）%、（61.3±4.9）%、（80.4±2.8）%，且OGD/R+CAR(3、9 mmol/L）组Phospho-Nrf2(S40）表达增加更为明显（ 图7 ）。
肌肽对OGD/R诱导损伤后AS核内Phospho-Nrf2(S40）表达量影响　标尺＝100 μm
The effect of carnosine on the expression of Phospho-Nrf2(S40) in AS nucleus after OGD/R-induced injury　bar=100 μm
2.8　肌肽对OGD/R诱导损伤后AS内Nrf2与Phospho-Nrf2(S40）蛋白表达水平影响
Western blotting法检测蛋白表达水平，与对照组比较，模型组AS内Phospho-Nrf2(S40）蛋白表达水平明显减低，差异有统计学意义（ P<0.01）；与模型组相比，OGD/R+CAR（1、3、9 mmol/L）组蛋白表达水平明显增高（ P<0.01），且呈浓度依赖性，而各组总Nrf2表达量无显著变化（ 图8 ）。
肌肽对OGD/R诱导损伤后AS内Nrf2与Phospho-Nrf2(S40)蛋白表达水平影响

A ：Nrf2、Phospho-Nrf2(S40)、β-actin蛋白表达免疫印迹图　 B ：Phospho-Nrf2(S40)/Nrf2统计直方图　** P<0.01，与对照组比较　 ## P<0.01，与模型组比较

The effect of carnosine on the expression of Nrf2 and Phospho-Nrf2(S40) protein in AS after OGD/R-induced injury

A: Western blotting diagram of Nrf2, Phospho-Nrf2(S40) and β-actin protein expression; B: statistical histogram of Phospho-Nrf2(S40)/Nrf2　** P<0.01 vs Control group; ## P<0.01 vs OGD/R group

2.9　肌肽对OGD/R诱导损伤后AS核内Nrf2下游产物HO-1、NQO1 mRNA表达水平影响
采用qPCR法检测AS核内Nrf2下游产物HO-1、NQO1 mRNA的表达，与对照组相比，模型组HO-1、NQO1 mRNA的表达减少，差异有统计学意义（ P< 0.01）；与模型组相比，OGD/R+CAR（1、3、9 mmol/L）组HO-1、NQO1 mRNA的表达增加，差异均有统计学意义（ P<0.01），且呈浓度依赖性（ 图9 ）。
肌肽对OGD/R诱导损伤后AS核内Nrf2下游产物HO-1、NQO1 mRNA表达影响

** P<0.01，与对照组比较　 ## P<0.01，与模型组比较

The effect of carnosine on the mRNA expression of Nrf2 downstream products HO-1 and NQO1 in AS nucleus after OGD/R-induced injury

** P<0.01 vs Control group; ## P<0.01 vs OGD/R group

3　讨论
AS是哺乳动物中枢神经系统含量最丰富的细胞类型，有很多突起，填充在神经细胞的胞体及其突起之间，对神经细胞起支持和分隔的作用，参与信号传递，调节突触可塑性及动作电位的传播，维持中枢神经系统微环境稳态 [ 11 , 12 , 13 , 14 , 15 ]。对AS进行氧糖剥夺损伤处理，根据不同氧糖剥夺时间细胞存活率，最终选定氧糖剥夺6 h再恢复正常培养24 h进行实验，结果发现，与对照组相比，模型组AS的存活率下降、LDH释放量及凋亡增多，提示缺氧6 h、复氧24 h对AS造成一定程度损伤，该结果与文献报道一致 [ 16 ]。在此基础上观察肌肽的药效，结果发现，与模型组相比，OGD/R+ CAR组AS存活率显著提高，细胞凋亡率及LDH释放量减少，且肌肽浓度越高改善效果越明显，表明肌肽对OGD/R引起的损伤具有保护作用。在实验中增加了单加肌肽组（9 mmol/L），与对照组相比，单加肌肽组细胞形态、存活率均无明显变化，说明肌肽对于正常AS影响不大。
ROS作为参与细胞生长、分化、进展和死亡的信号介质，过高能引起组织脂质过氧化，导致神经元细胞死亡、脑功能受损 [ 17 , 18 ]。实验结果显示与对照组相比，模型组ROS生成显著增加，提示缺氧6 h、复氧24 h造成细胞氧化损伤；在此基础上施加肌肽预处理，相比于模型组，OGD/R+CAR组ROS生成受抑制，且随肌肽浓度增高抑制作用更显著，因此推测肌肽可能通过抑制ROS生成发挥抗氧化能力，保护细胞免受氧化应激诱导的细胞死亡 [ 19 , 20 ]。
正常情况没有受到外界刺激时，Nrf2在胞浆与Keap1结合，被泛素化而降解；在适当的氧化刺激下，Nrf2发生磷酸化，与Keap1解离并移位到细胞核内，与ARE结合，调控下游抗氧化蛋白，启动ARE调控的下游基因HO-1、NQO1等的表达，增强细胞对氧化应激的抗性，提高机体抗氧化能力 [ 21 , 22 , 23 ]。这条通路在维持细胞氧化还原平衡方面起关键作用 [ 18 ]。结果发现，与对照组相比，模型组AS内Phospho-nrf2(S40）蛋白表达量下降，核转位趋势减弱，其下游产物HO-1、NQO1表达量也下调；而采用不同浓度肌肽预处理AS后再给予氧糖剥夺损伤，Phospho-nrf2(S40)及其下游产物HO-1、NQO1表达量均上调，AS内Phospho-nrf2(S40)的核转位也随浓度呈增加趋势。因此推测OGD/R损伤后，极过量的ROS蓄积对细胞造成严重的氧化损伤，导致其功能受损，不能有效激活Phospho-Nrf2(S40)；而肌肽预处理对于氧糖剥夺造成的损伤起到保护作用，肌肽预处理使ROS处于较为适宜水平，触发Keap1-Nrf2-ARE信号通路，从而诱导下游抗氧化酶基因HO-1、NQO1的表达，提高机体抗氧化能力。研究表明氧糖剥夺损伤模型构建时间不同，对Phospho-Nrf2(S40）的影响各异 [ 24 ]，后续将对不同缺氧及复氧时间Keap1-Nrf2-ARE信号通路信号分子的变化趋势，以及肌肽对其影响进行进一步研究。
综上所述，肌肽预处理可有效降低氧糖剥夺造成的AS细胞损伤，其作用可能是肌肽通过发挥其抗氧化能力，激活Nrf2-ARE通路，进而增强其下游抗氧化酶HO-1、NQO1的表达，对AS产生保护作用。
参考文献
[1]
Michinaga S , Koyama Y . Dual roles of astrocyte-derived factors in regulation of blood-brain barrier function after brain damage[J]. Int J Mol Sci, 2019,20(3):571. DOI: 10.3390/ijms20030571 .
返回引文位置Google Scholar
百度学术
万方数据
[2]
Dossi E , Vasile F , Rouach N . Human astrocytes in the diseased brain[J]. Brain Res Bull, 20 18 ,136(1):139-156. DOI: 10.1016/j.brainresbull.2017.02.001 .
返回引文位置Google Scholar
百度学术
万方数据
[3]
Molofsky AV , Deneen B . Astrocyte development: a guide for the perplexed[J]. Glia, 2015,63(8):1320-1329. DOI: 10.1002/glia.22836 .
返回引文位置Google Scholar
百度学术
万方数据
[4]
Dringen R , Gutterer JM , Hirrlinger J . Glutathione metabolism in brain metabolic interaction between astrocytes and neurons in the defense against reactive oxygen species[J]. Eur J Biochem, 2000,267(16):4912-4916. DOI: 10.1046/j.1432-1327.2000.01597.x .
返回引文位置Google Scholar
百度学术
万方数据
[5]
Cabezas R , Baez-Jurado E , Hidalgo-Lanussa O ,et al. Growth factors and neuroglobin in astrocyte protection against neurodegeneration and oxidative stress[J]. Mol Neurobiol, 2019,56(4):2339-2351. DOI: 10.1007/s12035-018-1203-9 .
返回引文位置Google Scholar
百度学术
万方数据
[6]
Anderson MF , Blomstrand F , Blomstrand C ,et al. Astrocytes and stroke: networking for survival[J]?Neurochem Res, 2003,28(2):293-305. DOI: 10.1023/a:1022385402197 .
返回引文位置Google Scholar
百度学术
万方数据
[7]
杨文强，何鑫，白雪，等．肌肽对血管性认知障碍大鼠氧化应激及NF-κB信号途径的影响[J]．吉林大学学报（医学版), 2020,46(2):329-334. DOI: 10.13481/j.1671-587x.20200220 .
返回引文位置Google Scholar
百度学术
万方数据
[8]
白雪，于露，杨文强，等．肌肽对脂多糖诱导星形胶质细胞炎症因子释放的抑制作用及其机制[J]．吉林大学学报（医学版), 2021,47(2):330-337. DOI: 10.13481/j.1671-587x.20210211 .
返回引文位置Google Scholar
百度学术
万方数据
[9]
Galland F , Seady M , Taday J ,et al. Astrocyte culture models: molecular and function characterization of primary culture, immortalized astrocytes and C6 glioma cells[J]. Neurochem Int, 2019,131(12):104538. DOI: 10.1016/j.neuint.2019.104538 .
返回引文位置Google Scholar
百度学术
万方数据
[10]
Sun X , Hu X , Wang D ,et al. Establishment and characterization of primary astrocyte culture from adult mouse brain[J]. Brain Res Bull, 2017,132(6):10-19. DOI: 10.1016/j.brainresbull.2017.05.002 .
返回引文位置Google Scholar
百度学术
万方数据
[11]
Ji RR , Donnelly CR , Nedergaard M . Astrocytes in chronic pain and itch[J]. Nat Rev Neurosci, 2019,20(11):667-685. DOI: 10.1038/s41583-019-0218-1 .
返回引文位置Google Scholar
百度学术
万方数据
[12]
Freeman MR . Specification and morphogenesis of astrocytes[J]. Science, 2010,330(6005):774-778. DOI: 10.1126/science.1190928 .
返回引文位置Google Scholar
百度学术
万方数据
[13]
Liu Z , Chopp M . Astrocytes, therapeutic targets for neuroprotection and neurorestoration in ischemic stroke[J]. Prog Neurobiol, 2016,144(9):103-120. DOI: 10.1016/j.pneurobio.2015.09.008 .
返回引文位置Google Scholar
百度学术
万方数据
[14]
Liddelow SA , Barres BA . Reactive astrocytes: production, function, and therapeutic potential[J]. Immunity, 2017,46(6):957-967. DOI: 10.1016/j.immuni.2017.06.006 .
返回引文位置Google Scholar
百度学术
万方数据
[15]
Siracusa R , Fusco R , Cuzzocrea S . Astrocytes: role and functions in brain pathologies[J]. Front Pharmacol, 2019,10(9):1114. DOI: 10.3389/fphar.2019.01114 .
返回引文位置Google Scholar
百度学术
万方数据
[16]
Wang XF , Hu WW , Yan HJ ,et al. Modulation of astrocytic glutamine synthetase expression and cell viability by histamine in cultured cortical astrocytes exposed to OGD insults[J]. Neurosci Lett, 2013,549(8):69-73. DOI: 10.1016/j.neulet.2013.06.013 .
返回引文位置Google Scholar
百度学术
万方数据
[17]
Hatanaka H , Hanyu H , Fukasawa R ,et al. Peripheral oxidative stress markers in diabetes-related dementia[J]. Geriatr Gerontol Int, 2016,16(12):1312-1318. DOI: 10.1111/ggi.12645 .
返回引文位置Google Scholar
百度学术
万方数据
[18]
Zhang J , Wang X , Vikash V ,et al. ROS and ROS-mediated cellular signaling[J]. Oxid Med Cell Longev, 2016,2016(2):1-18. DOI: 10.1155/2016/4350965 .
返回引文位置Google Scholar
百度学术
万方数据
[19]
Fresta CG , Fidilio A , Lazzarino G ,et al. Modulation of pro-oxidant and pro-inflammatory activities of M1 macropha ges by the natural dipeptide carnosine [J]. Int J Mol Sci, 2020,21(3):776. DOI: 10.3390/ijms21030776 .
返回引文位置Google Scholar
百度学术
万方数据
[20]
Baky NAA , Fadda L , Al-Rasheed NM ,et al. Neuroprotective effect of carnosine and cyclosporine-A against inflammation, apoptosis, and oxidative brain damage after closed head injury in immature rats[J]. Toxicol Mech Methods, 2015,26(1):1-10. DOI: 10.3109/15376516.2015.1070224 .
返回引文位置Google Scholar
百度学术
万方数据
[21]
Nakaso K , Yano H , Fukuhara Y ,et al. PI3K is a key molecule in the Nrf2-mediated regulation of antioxidative proteins by hemin in human neuroblastoma cells[J]. FEBS Lett, 2003,546(2-3):181-184. DOI: 10.1016/s0014-5793(03)00517-9 .
返回引文位置Google Scholar
百度学术
万方数据
[22]
Maher J , Yamamoto M . The rise of antioxidant signaling-the evolution and hormetic actions of Nrf2[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2010,244(1):4-15. DOI: 10.1016/j.taap.2010.01.011 .
返回引文位置Google Scholar
百度学术
万方数据
[23]
Soane L , Li DW , Fiskum G ,et al. Sulforaphane protects immature hippocampal neurons against death caused by exposure to hemin or to oxygen and glucose deprivation[J]. J Neurosci Res, 2010,88(6):1355-1363. DOI: 10.1002/jnr.22307 .
返回引文位置Google Scholar
百度学术
万方数据
[24]
Liu L , Zhao Z , Yin Q ,et al. TTB protects astrocytes against oxygen-glucose deprivation/reoxygenation-induced injury via activation of Nrf2/HO-1 signaling pathway[J]. Front Pharmacol, 2019,10(7):792. DOI: 10.3389/fphar.2019.00792 .
返回引文位置Google Scholar
百度学术
万方数据
备注信息
A
赵艳，高级实验师，E-mail： mocdef.3ab6137nayoahz；
B
杨菁，教授，E-mail： nc.defudabe.umzjgnijgnay
C
辽宁省自然科学基金 (2019-ZD-0603)
辽宁省教育厅面上项目 (2021LJKZ0823)
评论 （0条）
注册
登录
时间排序
暂无评论，发表第一条评论抢沙发
最新推荐
更多
中国药物性肝损伤诊治指南（2023年版）
中国医药生物技术协会药物性肝损伤防治技术专业委员会 等
中华肝脏病杂志 2023,31(04)
中国霍奇金淋巴瘤的诊断与治疗指南（2022年版）
中国抗癌协会血液肿瘤专业委员会 等
中华血液学杂志 2022,43(09)
中国首次复发多发性骨髓瘤诊治指南（2022年版）
中华医学会血液学分会浆细胞疾病学组 等
中华血液学杂志 2022,43(10)
中国多发性骨髓瘤诊治指南（2022年修订）
中国医师协会血液科医师分会 等
中华内科杂志 2022,61(05)
MedAI助手（体验版）
文档即答
智问智答
机器翻译
回答内容由人工智能生成，我社无法保证其准确性和完整性，该生成内容不代表我们的态度或观点，仅供参考。
生成快照
文献快照

你好，我可以帮助您更好的了解本文，请向我提问您关注的问题。

0/2000

《中华医学会杂志社用户协议》 | 《隐私政策》

《SparkDesk 用户协议》 | 《SparkDesk 隐私政策》

网信算备340104764864601230055号 | 网信算备340104726288401230013号

技术支持：

历史对话
本文全部
还没有聊天记录
设置
模式
纯净模式沉浸模式
字号
小中大