基于网络药理学的甘草附子汤治疗类风湿关节炎的作用机制

葛菁; 曹永仓; 张庆菲

doi:10.11655/zgywylc2024.05.001

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中国药物与临床

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基于网络药理学的甘草附子汤治疗类风湿关节炎的作用机制

作者及单位信息

出版日期： 2024 -03 -15 ·

DOI： 10.11655/zgywylc2024.05.001

Mechanism of Gancao Fuzi Tang in the treatment of rheumatoid arthritis based on network pharmacology

Authors Info & Affiliations

Ge Jing

Administrative Office, Tai'an Traditional Chinese Medicine Hospital, Tai'an, Shandong 271000, China

Cao Yongcang

Department of Pharmacy, Tai'an Traditional Chinese Medicine Hospital, Tai'an, Shandong 271000, China

Zhang Qingfei

Department of Pharmacy, Tai'an Traditional Chinese Medicine Hospital, Tai'an, Shandong 271000, China

Published： 2024 -03 -15 ·

DOI： 10.11655/zgywylc2024.05.001

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摘要

目的通过网络药理学探讨甘草附子汤治疗类风湿关节炎（RA）的作用机制。

方法采用网络药理学方法，构建药物-靶点-疾病网络，进行富集分析，研究药物对靶点的作用、靶点的功能与疾病的相关关系，探讨甘草附子汤治疗RA涉及靶点和主要成分。

结果从中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）中筛选出有效成分127个，得到49个甘草附子汤治疗RA潜在靶点，建立"药物-靶点-疾病"网络，得到135节点，473条边。筛选出Degree值较高的槲皮素、山柰酚、柚皮素等10个活性成分，以及白细胞介素（IL）-6、表皮生长因子受体（EGFR）、IL-1β、TP53、过氧化物酶体增生激活受体（PPARG）等30个Degree值较高的靶点。

结论甘草附子汤治疗RA主要与脂多糖反应、血管调节和血管反应、脂质与动脉粥样硬化、糖尿病晚期糖基化终末产物-晚期糖基化终末产物受体（AGE-RAGE）信号通路和辅助性T细胞（Th17）细胞分化等信号通路有关，为扩大甘草附子汤的临床应用提供理论依据。

关键词：关节炎，类风湿;网络药理学;作用机制;甘草附子汤

ABSTRACT

ObjectiveTo explore the mechanism of Gancao Fuzi Tang in the treatment of rheumatoid arthritis (RA) through network pharmacology.

MethodsUsing network pharmacology methods, a drug-target-dis-ease network was constructed and enrichment analysis was performed to study the effect of the drug on the targets, the correlation between the function of the targets and the disease, in order to explore the targets and main compo-nents involved in the treatment of RA with Gancao Fuzi Tang.

ResultsA total of 127 effective ingredients were screened from the TCSMP database, and 49 potential targets for the treatment of RA with Gancao Fuzi Tang were identified. A "drug-target-disease" network was established with 135 nodes and 473 edges. A total of 10 active in-gredients with high degree values, including quercetin, kaempferol, and naringenin, as well as 30 targets with high degree values such as IL-6, EGFR, IL-1β, TP53, and PPARG were screened out.

ConclusionThe treatment of RA with Gancao Fuzi Tang is mainly related to the lipopolysaccharide response, vascular regulation and vascular response, lipid and atherosclerosis, diabetes AGE-RAGE signal pathway, Th17 cell differentiation and other signal pathways, which provides a theoretical basis for expanding the clinical application of Gancao Fuzi Tang.

KEYWORDS： Arthritis, rheumatoid;Network pharmacology molecular;Mechanisms of pharmacological action(TCD);Gancao Fuzi Tang

Corresponding author: Cao Yongcang, Email: mocdef.3ab61gnacgnoyoactrams

FUNDING:

Shandong Province Medical and Health Technology Development Plan Project（202213040613）

Shandong Province Traditional Chinese Medicine Technology Project（M-2023323）

Tai'an City Science and Technology Innovation Development Project（2021NS425）

Hospital Level Project of Tai'an Traditional Chinese Medicine Hospital（2022）

引用本文

葛菁,曹永仓,张庆菲. 基于网络药理学的甘草附子汤治疗类风湿关节炎的作用机制[J]. 中国药物与临床,2024,24(05)：273-277.

DOI:10.11655/zgywylc2024.05.001

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类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以免疫反应为特征的关节疾病 ^{[
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]}，主要有关节发炎、滑膜增生、血管新生、软骨及骨破坏、畸形等病理变化，常引起免疫功能紊乱或低下 ^{[
2
]}。此外，RA还通过累及关节以外的器官，导致肺病、心血管疾病以及抑郁症等疾病 ^{[
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,

5
]}。据世界卫生组织（World Health Organization，WHO）报告，近年来，我国RA发病率约为0.4%，患者数量增加与年龄增长相关 ^{[
6
]}。现代医学认为，RA的发生与遗传、感染、免疫等因素有关 ^{[
7
]}。

RA属于中医"痹证"范畴，以风、寒、湿邪为主要病因，累及肝、脾、胃、肾等脏腑。中医药治疗RA有独特优势，甘草附子汤作为中医药中常用的治疗方剂之一，其具有疏通经络、和解寒湿、祛除风湿的作用，临床应用广泛且疗效显著 ^{[
8
]}。甘草附子汤出自《伤寒论》，由甘草、附子、白术、桂枝构成，具有暖肌补中，益精气之功效。桂枝达上焦，能够去风解表、通阳化气；附子趋下焦，温经散寒、除湿解痛；白术至中焦，健脾去湿；甘草和中缓急，缓和诸药，可以避免桂枝、附子药力过猛，又可除去关节内风湿寒邪气。甘草附子汤能够温阳补中化风湿，又能够温经解表调营卫、祛风除湿。在治疗RA时能够减轻疼痛，改善关节功能，不良反应较小，而且甘草附子汤在临床应用中常常结合针灸、推拿等方法进行综合治疗，能明显降低炎性水平，减轻患者临床症状，调整患者的整体健康状况 ^{[
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10
]}。本研究运用网络药理学构建药物-靶点-疾病网络并进行分析，分析发现甘草附子汤涉及的有效成分和作用靶点，对其中的关联进行探索，挖掘甘草附子汤治疗RA的疗效和作用机制。

1　资料与方法

1.1　疾病相关靶点

采用中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）检索中药方剂甘草附子汤的活性成分和靶点，筛选条件：口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和类药性（drug likeness，DL）≥0.18，筛选出有效成分和符合条件的有效靶点，并将每个靶蛋白的名称输入蛋白质数据库（Universal Protein，Uniprot），获得靶蛋白相对应的靶基因名，靶基因名合并去重后，得到预测靶标。

以"Rheumatoid arthritis"为检索词，然后对人类基因数据库（The Human Gene Database，GeneCards）和人类孟德尔遗传数据库（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）进行检索，得到RA相关靶点。

1.2　交集靶点筛选及网络构建

利用R语言将组方潜在靶标与RA靶点取交集，使用Cytoscape 3.10.1网络软件绘制"活性成分-靶标"网络图，图中不同颜色节点代表药物、成分或靶标，边线代表三者间相互关系。

1.3　网络构建和核心靶标筛选

把交集靶点上传STRING平台，选择模式、蛋白种属、最小互作分数值分别为"multiple proteins" "Home sapiens" "0.4" ，其他参数选默认值，构建蛋白质-蛋白质网络模型。然后每个节点的Degree值导入R语言，筛选分值较高的节点作为核心基因。

1.4　富集分析

交集靶点导入R语言后，先进行基因本体论富集分析（gene ontology enrichment analysis，GO），再进行京都基因和基因百科全书通路富集分析（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）。以 P<0.05作为筛选标准，并对富集分析结果进行可视化处理 ^{[
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]}。

2　结果

2.1　甘草附子汤有效成分及靶点

根据设定条件，从TCMSP数据库中共筛选出有效成分127个，其中甘草的活性成分92个，附子的活性成分21个，白术的活性成分7个，桂枝的活性成分7个，根据其有效成分筛选出1 896个有效靶点符合条件，去重后，在Uniprot数据库中找到70个有对应基因名的靶点。

2.2　甘草附子汤治疗RA相关靶点的筛选

以"类风湿关节炎"为关键词，在GeneCards数据库、OMIM数据库中进行检索，共筛选出疾病相关靶点5 973个，然后与甘草附子汤靶点映射，得到49个甘草附子汤治疗RA潜在靶点，见图1 。

图1 甘草附子汤靶点与RA疾病靶点Venny图

2.3　甘草附子汤治疗RA"药物-靶点-疾病"网络的构建

将49个甘草附子汤治疗RA潜在靶点与方剂活性成分进行映射，建立甘草附子汤活性成分与靶基因对应关系，得到84个治疗RA疾病相关活性成分。将以上活性成分、靶点导入Cytoscape软件中，建立"药物-靶点-疾病"网络，共有135节点，473条边，见图2 。通过Network Analyzer计算，筛选出Degree值较高的10个活性成分，包括槲皮素、山柰酚、柚皮素、Shinpterocarpin、Licoagrocarpin、2-[（3R）-8，8-二甲基-3，4-二氢-2H-吡喃并[6，5-f]色烯-3-基]-5-甲氧基苯酚、β-谷甾醇、甘草查尔酮A、7-甲氧基-2-甲基异黄酮、光甘草定，这些活性成分对治疗RA可能起到重要的药理学作用。

图2 甘草附子汤活性成分-靶点网络图

2.4　蛋白质-蛋白质相互作用的网络构建

将甘草附子汤潜在靶点输入STRING数据库，分析后下载PPITSV文件，得到49个蛋白质节点，构成346个相互作用关系，见图3 ，平均节点数14.1，平均局部聚类系数0.668。将STRING中导出数据导入R语言进行靶点的相关关系分析，靶点的Degree值越大，表明靶点在网络中越重要。筛选出30个Degree值较高的靶点，其中白细胞介素-6（inter-leukin-6，IL-6）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、TP53、过氧化物酶体增生激活受体γ（peroxisome proliferative activated receptor gamma，PPARG）、B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，BCL-2）、信号转导和转录激活物（signal transducer and acti-vator of transcription 3，STAT-3）、低氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1A，HIF-1A）等8个靶点Degree值>50，在网络中处于关键位置，在甘草附子汤治疗RA中发挥重要作用。

图3 甘草附子汤治疗类风湿关节炎潜在靶点蛋白质-蛋白质相互作用网络图

注：a.蛋白互作网络分析图；b.蛋白相关关系分析柱状图。

2.5　GO富集分析及KEGG通路富集分析

利用R语言富集分析交集靶点，获得103个GO功能条目（ P<0.05）。GO富集分析得出，主要与脂多糖反应、血管调节和血管反应等有关，涉及核受体活性、转录因子活性、DNA结合转录激活剂活性等。根据 P值大小，从中选出前20个条目绘制柱状图，见图4 。

图4 甘草附子汤治疗类风湿关节炎基因本体论富集分析

KEGG分析涉及110条目，主要涉及脂质与动脉粥样硬化、晚期糖基化终末产物-晚期糖基化终末产物受体（advanced glycation end products-RAGE，AGEs RAGE）信号通路和辅助性T细胞17（T helper cell 17，Th17）等。根据 P值大小，从中选出前20个条目绘制柱状图，见图5 。

图5 甘草附子汤治疗类风湿关节炎通路富集分析

3　讨论

RA以滑膜炎为特征，会引起促炎-抑炎平衡紊乱，最初为滑膜炎持久反复发作、血管翳形成，破坏软骨，逐渐导致活动受限、关节畸形等后果 ^{[
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]}。中医药治疗RA，疗效显著，不良反应小，临床患者广泛接受。大量临床研究证实，甘草附子汤是有效治疗RA的经典方。文清华等 ^{[
15
]}研究结果显示，甘草附子汤加减治疗RA能够降低血清骨代谢指标、中医证候积分，调节血清相关因子红细胞沉降率（erythrocyte sedimentation Rate，ESR）、超敏C反应蛋白（high sensitivity C-reactive protein，hs-CRP）、类风湿因子（rheumatoid factor，RF）水平；曹江山等 ^{[
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]}用甲氨蝶呤常规治疗作为对照，研究了甘草附子汤的临床疗效，结果显示，试验组ESR、RF、IL-1、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）水平大幅降低，患者关节痛指数、关节肿指数、握力等主要指标优于对照组，提示甘草附子汤具有较好的疗效 ^{[
10
]}。

根据网络构建分析结果，甘草附子汤治疗RA主要涉及槲皮素、山柰酚、柚皮素、Shinpterocarpin、Licoagrocarpin等活性成分，结合富集分析，甘草附子汤治疗RA主要涉及核心靶点IL-6、EGFR、IL-1β、TP53、PPARG、BCL-2、STAT-3、HIF-1A等，以及脂质与动脉粥样硬化、Th17细胞分化和TNF-α信号通路等。

相关研究表明，IL-1β和IL-6在RA患者关节滑膜液高表达，促进关节组织炎症形成 ^{[
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]}。PPARG是核激素受体家族配体激活转录因子，涉及糖脂质代谢、细胞分化及炎症反应等，PPARG激动剂能在炎症反应、氧化应激和代谢紊乱等方面发挥重要作用。属于酪氨酸激酶受体家族的EGFR，其配体包括转化生长因子α、双调蛋白、表皮生长因子等，是一类骨组织细胞调节因子，参与关节软骨细胞、表层细胞合成与分解代谢，在骨组织代谢中起着重要调节作用。EGFR及其配体共同参与骨组织代谢，发挥着不可或缺的作用 ^{[
17
]}。

槲皮素作为一种重要的中药成分，药理作用包括抑制牙龈卟啉单胞菌脂多糖（lipopolysaccharide from P. gingivalis，Pg-LPS）诱导的RAW264.7细胞的炎症因子表达，能够使IL-6、IL-1β、TNF-α等蛋白表达呈剂量依赖性地下调 ^{[
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]}；贾庆运等 ^{[
19
]}研究得出，槲皮素能够减轻RA成纤维样滑膜细胞炎症因子的表达；先梦麟等 ^{[
20
]}研究表明，山柰酚可能通过调控炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α和衰老相关基因p16/p21的表达，减少炎症因子释放，防止免疫细胞过早衰老，在体外和体内，也可降低破骨细胞化、关节炎发生频率 ^{[
21
]}。此外，已有研究报道，β-谷甾醇对TNF-α诱导的关节炎成纤维细胞（MH7A）的增殖、迁移、侵袭有抑制作用，也能够抑制炎症因子的分泌 ^{[
22
]}，抑制类风湿性滑膜的血管生成，阻止转录因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）相关的基因表达，通过调节巨噬细胞的极化减轻小鼠的类风湿性炎症 ^{[
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24
]}。综上所述，甘草附子汤可能通过减轻炎症、抑制破骨细胞活性等途径发挥治疗RA作用。

近几年，本课题组致力于研究有毒中药药理学研究，从临床实践中发现甘草附子汤取得较好的临床疗效，本研究基于网络构建和富集分析，探讨了中药方剂甘草附子汤治疗RA涉及到的作用机制，甘草附子汤通过调节多个靶点、多个通路发挥作用，从而影响关节炎的发展和炎症的消退，与相关文献的临床研究成果吻合 ^{[
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25
]}，为扩大其临床应用提供了理论依据。不过，仍然需要进一步的动物实验和临床研究验证，从分子水平、细胞水平、动物模型、临床试验等多个层面开展研究，全面深入地揭示其作用机制，为RA中医药治疗提供更为可靠科学的依据。随着网络药理学和实验药理学等学科的发展，对中医药组方的物质基础、理论基础和实验结果进行系统分析探索，对扩大中医药临床应用范围，阐明中医药治疗疾病的作用机制将得到更多的突破，给RA患者带来更多福祉。

摘要
1　资料与方法
2　结果
3　讨论
参考文献

参考文献

[1]

Singh JA . Treatment guidelines in rheumatoid arthritis[J]. Rheumat Dis Clin North Am， 2022，48（3）：679-689. DOI： 10.1016/j.rdc.2022.03.005 .