膝关节骨性关节炎(KOA)是导致中老年人膝关节疼痛和残疾的主要原因。KOA是一种复杂的疾病,受多种致病因素控制,其中包括一般体质因素如年龄、性别、肥胖、家族史等以及膝关节局部不利的机械因素如创伤、运动损伤及日常劳损。该病患病率与遗传因素有关,目前保守治疗作用有限,且膝关节置换术会伴有诸多并发症。间充质干细胞(MSCs)最初在骨髓中被发现,继而在外周血、脐带血、骨骼肌、心脏和脂肪组织也可提取,具有较高的可塑性和多能性。MSCs的发现为治疗KOA提供了一种新的方法,由于其具有强大的软骨修复及再生功能,近年来研究者对MSCs治疗KOA的疗效、安全性及作用机制进行了大量试验研究。旨在对上述研究进行系统综述。
骨关节炎(osteoarthritis,OA)是世界上发病率最高的疾病之一,最终将导致患者软骨变性、慢性关节疼痛以及残疾[1]。预计至2020年将成为第四大致残因素,严重影响患者的生活质量[2]。膝关节骨性关节炎(knee osteoarthritis,KOA)是临床上最常见的慢性骨关节炎[3],由于膝关节软骨无血供,营养来源于4周关节液的滋养,损坏后很难新生,导致目前临床中缺乏有效的治疗措施来修复软骨破损[4]。保守治疗方法(包括中医理疗、服用消炎药、关节注射等)虽可用于减轻疼痛和改善关节功能[5],但若保守治疗疗效不佳,膝关节置换术是唯一可行的治疗方案[6]。全膝关节置换术(total knee replacement,TKA)目前仍存在许多并发症[7],多达20%的患者在TKA后会复发膝关节疼痛和其他问题[8],且高达2%的患者出现重大并发症,如死亡、肺栓塞和严重感染[9]。在此情况下,研发高效、经济的保膝治疗方法对KOA患者意义重大。干细胞疗法提供了一种修复软骨技术。间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSCs)作为一种多功能的间质细胞能分化为多种细胞类型,包括成骨细胞、软骨细胞、肌细胞和骨髓脂肪组织等[10],且还具有取材容易、组织相容性好及表型稳定等优点[11],最重要的是,它们可分泌生长因子和趋化因子来增加血管生成和细胞增殖[12]。这些特性与优点使MSCs成为一种良好的KOA损坏软骨修复剂[13]。
MSCs可从脂肪、骨髓、髌下脂肪垫和脐血等提取得到。MSCs最初来源于骨髓,且至今仍为最常用的来源,其被称为骨髓基质干细胞[14]。Till和McCulloch[15]于20世纪60年代首次揭示了骨髓细胞的克隆性质[15]。2006年,我国首先从胎盘和脐带中提取出充质干细胞,此类来源的MSCs不但拥有其他MSCs的生物学特征,且具有以下优势:①脐血中的干、祖细胞更初级,有更强的分裂能力。②免疫细胞较幼小,免疫能力低,不会导致免疫反应。③干细胞易被提取,纯度高,无其他细胞污染等[16]。1995年,完成了第一个MSCs的临床试验。该研究纳入15例患者注射了体外培养的MSCs,以测试该方法的安全性[17]。此后,大量的临床试验相继展开。
由于MSCs可直接在关节内注射,可避免手术和相关的副作用,如骨膜肥厚和骨化、免疫反应和异种移植物植入引起的疾病传播[18]。更重要的是,简单易行的注射可提供更便捷、易于接受的治疗环境。近年来,其有效性、安全性与易操作性已受到国内外医务人员的广泛关注。临床中应用MSCs治疗KOA患者主要分为以下几步:①评估患者的整体情况,若患者不存在严重感染、严重精神障碍、心功能不全等的情况下,对患者细胞动员4~5 d。②使用细胞分离机对MSCs进行采集与分离。③进行体外MSCs培养及扩增。④对培养成功的MSCs进行自体移植[19],目前主流的移植手段包括局部注射MSCs、载MSCs支架植入以及混合注射。
局部注射MSCs是治疗KOA最简单、最方便的方法[20]。其技术的优势在于不仅可加快关节软骨的恢复,还可预防OA导致的退行性病变[21]。2002年,Wakitani和Yamamoto[22]为促进关节软骨破坏的恢复,其团队将自体间充质细胞移植到软骨破损部分。结果发现,间充质细胞移植2周后原缺损的全部区域被软骨占据,软骨细胞与宿主骨接触的修复性软骨开始生长,且开始浸润血管,移植4周后修复性软骨与自体软骨天然融合。一年后,Murphy等[23]对切除内侧半月板以及前交叉韧带模拟关节损伤的动物进行研究,发现注入自体间充质细胞的动物内侧半月板有明显的再生迹象,且新形成的组织中存在移植细胞。这些研究结果初步证实了直接注入MSCs对KOA患者软骨修复的有效性。
2008年,Centeno等[24]从骨髓中分离MSCs并进行体外培养治疗经MR证实为KOA的患者。其研究结果发现,在注射MSCs后24周,患者通过MR检查显示有明显的软骨和半月板生长,运动范围增大,VAS疼痛评分降低。结果证明,自体MSCs培养及经皮注射可明显促进关节软骨生长,减轻疼痛,增加关节活动度,其对骨关节炎和半月板损伤的微创治疗具有重要的意义。2012年,Koh和Choi[25]从髌下脂肪垫中分离MSCs并对KOA患者进行体外培养治疗。该研究对25例KOA患者进行干细胞注射联合关节镜下清创,该手术通过外侧门静脉处皮肤切口,从髌下脂肪垫内侧获取脂肪滑膜,体外培养MSCs后在门诊进行注射。首先将膝关节抽吸术用于关节血肿,之后在膝关节注射富血小板血浆(platelet rich plasma,PRP)MSCs混合液,最后使患者膝关节被动弯曲和伸展几次,以便让PRP干细胞在成为凝胶之前分布在关节各处。术后只有1例患者出现明显疼痛和肿胀,2周后自行消退。试验组患者经Lysholm评分、Tegner活动量表以及VAS评分在最后一次随访时均有显著改善。2016年,Wang等[26]通过关节内注射脐源性MSCs治疗退行性KOA患者并探讨其安全性和有效性。发现注射细胞1周后,治疗组疼痛和肿胀发生率高于安慰剂组,但未出现严重不良反应,治疗后1~6个月,MSCs治疗组Lysholm膝关节功能评分、WOMAC评分量表及SF-36量表评分均明显优于治疗前,而安慰剂组治疗前后Lysholm膝关节功能评分、SF-36量表评分无显著差异。两组比较发现,治疗后2个月内各项评分并无显著差异,但MSCs治疗组3~6个月评分明显优于安慰剂组。结果说明应用脐源性MSCs关节内注射可提高患者关节功能和生活质量,且MSCs在植入1个月后起效。以上研究结果证实无论是骨髓源、脂肪源还是脐血源MSCs均有良好的软骨再生作用以及对KOA明确的治疗意义。对于MSCs植入剂量问题,Jo等[27]认为MSCs注射剂量为1.0×108单位时,可在最大程度上改善KOA患者膝关节的功能和疼痛,且不会出现不良事件。3年后,该团队研究结果表明,注射高剂量的MSCs(1.0×108)较中剂量组(5.0×107)以及低剂量组(1.0×107)种植出的软骨质量好,且中、低剂量组在植入1年后软骨易损坏[28];但对于同一问题,Pers等[29]团队发现接受低剂量(2.0×106)MSCs治疗的患者较中剂量(1.0×107)和高剂量(5.0×107)治疗后疼痛水平和功能改善明显。
MSCs支架是为MSCs提供养料以及稳定环境的一种组织,按其质地不同可分为胶原蛋白、纤维、透明质酸(hyaluronic acid,HA)等类型[30]。在MSCs技术提出之前,就曾有研究者使用支架技术运输体外培养的软骨细胞植入关节面上,但效果欠佳。MSCs技术兴起后,Lamo-Espinosa等[31]探索MSCs支架治疗KOA的安全性和有效性,并确定最佳剂量。该研究将30例诊断为KOA的患者随机分为两组,对照组为关节内单独注射HA,治疗组使用注射剂量分别为1.0×107和1.0×108的MSCs联合HA支架,随访12个月。结果发现治疗组软骨修复效果优于对照组,且在细胞剂量为1.0×108的情况下关节软骨修复效果最好,可最大程度地改善KOA的功能。此研究成果确定了未来的试验方向;但该实验随访时间较短,未能明确MSCs支架治疗后的长期效果。为探索MSCs支架技术的长期有效性,Park等[32]对异基因脐源性MSCs联合HA支架技术的治疗效果进行了为期7年的临床试验。该研究对严重软骨破损患者进行MSCs支架治疗,术后3个月在关节镜检中发现有完整的新生软骨,在6个月时VAS评分和IKDC膝关节量表提示疼痛减轻,1年时植入关节组织表现为透明软骨,3年时MR检查显示再生软骨持续存在,7年时关节无成骨或肿瘤发生。该研究结果说明应用这种新型MSCs联合支架再生膝关节软骨是长期安全有效的。同样,使用胶原蛋白等其他材料作为MSCs支架也被证明具有良好的治疗效果[33]。Tseng等[34]进行了胶原蛋白支架承载异种MSCs软骨修复效果的动物实验,其将猪膝关节前交叉韧带横切,手术诱导OA。4个月后,使用胶原蛋白支架承载异种MSCs嵌入软骨损伤区域并设立对照组进行对比,结果发现所有前交叉韧带切开术动物均出现骨关节炎改变。在支架联合MSCs诱导14 d后,动物膝关节表达出SOX9、COMP等软骨标记物。植入5个月后,膝关节再生组织质量支架联合MSCs组明显优于对照组。实验结果证明胶原蛋白、纤维、HA等支架材料联合MSCs可有效地诱导软骨修复。
混合注射即MSCs联合生长因子、细胞因子与支架夹杂植入,使用支架提供载体,生长因子提供催化作用。Turajane等[35]对5例KOA患者关节镜下植入MCS联合自体外周血干细胞,使用HA作为支架并添加生长因子进行培养催化,在1个月和6个月时所有患者的WOMAC膝关节评分均有显著改善,且停用止痛药治疗未见不良反应。电镜扫描显示MSCs附着于关节表面并进行增殖,且支架上蛋白多糖和糖胺多糖含量增加,提示透明软骨存在。该研究结果初步说明了MSCs支架混合生长因子技术的治疗作用,为以后的研究提供了新的方向;但该试验未进行纳入患者的分组,方法较不严谨。随后,该团队继续研究MSCs混合注入技术并探索该技术的临床价值,即该技术可有效地减少TKA纳入结局指标。该研究将保守干预失败且符合TKA手术指证的KOA患者分为3组:第1组为MSCs联合HA,且使用粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)进行调节,第2组在第1组基础上去掉G-CSF,第3组为仅使用HA干预。观察12个月发现,除第3组外,其余两组均未进行TKA手术,且第1组与第2组在6个月和12个月的WOMAC总分明显高于第3组。说明MSCs、生长因子联合支架植入技术可有效增强保守治疗KOA的效果[36]。
综上所述,在今后的研究中,作为遗传信息载体的外泌体应给予更多关注。目前已有研究结果证明其所具有的优势大于其对应的MSCs。①外泌体是细胞分泌的小生物膜囊泡。与MSCs不同的是,其形状更小、更为简单、容易生产、提取以及运输,甚至更易通过审查[37]。②MSCs外泌体(mesenchymal stem cell exosomes,ESC-MSCs)没有细胞的活性,解决了使用MSCs过程中产生的肿瘤风险。③ESC-MSCs是药物传递的理想载体,因ESC-MSCs包裹着丰富的蛋白质和RNA,可通过质膜将其传递到靶细胞中,而被人体很好地耐受[38]。ESC-MSCs已被证实存在缓解OA的潜力。研究结果发现,在关节内注射ESC-MSCs可减轻软骨破坏和基质的降解[39]。
近年来,干细胞已成为生物医学研究的热点,尤其在再生医学领域[40],使用MSCs治疗KOA的研究日益增加,且该技术对软骨修复的效果令人鼓舞;但对于MSCs的剂量、干预时机、类型、传递方式和路径等问题仍不十分明确,因此,尚需要大量的大样本以及多中心的试验来研究MSCs治疗KOA的诸多问题。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突