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肾移植是目前临床上治疗肾脏器官功能丧失最常用的手段，而供者特异性抗体(donor specific antibody，DSA)可攻击移植肾内皮细胞，导致肾移植术后发生抗体介导的急性排斥反应。因此准确地测定患者血液中DSA的水平显得尤为重要。DSA检测方法由最早的补体依赖性细胞毒试验(complement dependent cytotoxicity，CDC)，发展到较为敏感的抗人球蛋白-CDC(anti-human globulin-CDC，AHG-CDC)、流式细胞仪交叉配型(flow cytometry crossmatch，FCXM)以及酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)。随着分子生物学技术的蓬勃发展，DSA检测向更为精准和高通量的流式磁珠Luminex法过渡。
上世纪90年代，一种集流式细胞术、激光、数字信号处理及传统化学技术为一体的新型生物分子检测技术—液相芯片技术应运而生[1]。在美国Luminex公司不断地改进更新下，该技术逐渐拥有高通量、所需样本量小、操作简单便捷、特异性强、灵敏度高、准确性高、重复性好、费用低、检测范围广等优点，从而在基础研究、临床诊断等领域得到广泛的应用[2,3]。该体系采用悬浮式点阵技术。该技术含点阵信号识别和检测信号识别两部分，由微球、探针分子、被检测物、报告分子4个单元组成[4](图1，摘自www.mbl.co.jp，有修改)。悬浮于液相中大小均一(约5.6 μm)的圆形微球有两个显著特点：(1)采用物理或化学方法进行编码分类，不同编码类别的微球即可区分不同的特异性反应；(2)微球表面的羧基等基团偶联探针分子，能与被检测物的生物分子特异性结合。因此，当将待检样品加入到液相系统时，待检样本中的目标分子就会特异性地识别探针，随之加入的报告分子藻红蛋白，则会进一步使交联探针的微球携带上藻红蛋白。当进行检测时，流式细胞术将微球排列成单列依次通过检测通道，红色和绿色两束激光分别对单个微球进行照射。红色激光激发微球自身的荧光物质根据荧光强度比率的不同将微球进行分类，从而定性分类不同的特异性反应；绿色激光则通过检测目标分子上结合的藻红蛋白的数量[1]，从而定量微球上结合的目的分子的数量。利用这种一一对应的关系，即可实时完成对同一个样品中含有的多种不同分子进行定性定量检测[5]。
经过荧光编码的微球，其探针与受者血清中的人类白细胞抗原(human leukocyte antigene，HLA)抗体发生特异性结合后，加入可特定识别HLA抗体的报告分子藻红蛋白，进而完成Luminex对HLA抗体的检测。1998年，Pei等[6]首先采用HLA抗原包被的微球流式检测HLA Ⅰ类和Ⅱ类抗体。直到2006年，Gibney等[7]才首次报道采用Luminex技术检测肾移植患者血清中的DSA水平，其基本步骤包括：收集移植患者血清、血清与包被有HLA抗原的微球孵育、洗涤、与PE偶联的抗人IgG二抗孵育、上机、分析数据，与供受者的HLA高分辨分型结果相比较，当抗体结果中含有针对供者错配型别的抗体时即为DSA。目前采用Luminex xMAP技术检测DSA的试剂盒有两种：One Lambda(LABScreen® single antigen)和Tepnel Lifecodes(donor specific antibody Xm-DSA)。二者在微球包被、孵育过程、检测靶点、敏感度上均有所不同(表1)。以One Lambda公司试剂盒为例，为了确定某磁珠样本是否为阳性，需要计算出标准背景比NBG(normalized background ratio，NBG)和相对标准背景比Cut off值，Cut off值≤1时为阴性，1<Cut off值≤2时为灰色区，4≤Cut off值≤8时为阳性、Cut off值>8时为强阳性。通过比对阳性磁珠所对应的标记HLA抗原信息，即可得出该样本DSA的强弱。
One Lambda和Tepnel Lifecodes公司DSA检测方法比较
One Lambda和Tepnel Lifecodes公司DSA检测方法比较
| 检测方法 | 微球包被成分 | 是否需要供者淋巴细胞 | 孵育条件 | 结果分析软件 | 检测结果 | 敏感度 | 检测价格 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| LABScreen® Single Antigen | 重组HLA抗原 | 不需要 | 室温30 min | HLA Fusion | 虚拟、全面、特异 | 高 | 稍贵 |
| Xm-DSA | 抗HLA Ⅰ类和Ⅱ类抗体 | 需要 | 室温30 min | MATCHIT-Antibody | 真实、非特异 | 低 | 相对便宜 |
CDC方法普遍认为是检测DSA的金标准[8]，但它也存在诸多问题：(1)由于该方法采用的是淋巴细胞进行检测，而待检血清中的抗体不仅可以识别HLA抗原分子，它还会识别其它无关的细胞膜表面分子，特异性不强[9]；(2)由于该方法的实现基于补体激活途径，而IgG2、IgG4等特定亚型的抗体并不能固定补体，因此这些类型的DSA并不能通过该方法检测出来[10]。后续发展出的AHG-CDC法通过改进加入固定补体的抗人IgG抗体，从而实现对非补体固定HLA抗体的检测[11]。FCXM方法的引进则进一步增强了检测低水平HLA抗体的能力[12]，但是基于淋巴细胞分析的流式细胞术检测，尽管十分灵敏，却存在着与CDC法、AHG-CDC法相同的问题，即缺乏特异性。基于HLA抗原固相化原理的ELISA法很好地解决了这一难题[13]。将HLA抗原包被在96孔板上，可同时识别非补体活化型HLA抗体和补体活化型HLA抗体，且不与无关的细胞膜表面分子反应。然而，ELISA法也有自身的局限性：(1)包被HLA抗原的96孔板一般需要大量的血清样本来捕获感兴趣的DSA抗体；(2)孔表面积大以及捕获抗体的疏水性等都可能会导致DSA抗体的非特异性结合；(3)ELISA法一般通过酶促级联反应引起信号放大以达到DSA检测的敏感性，然而这种放大并不总是线性相关的，因此得出的结果会有一定的偏差[14,15]。同样基于固相化原理的Luminex方法，综合了ELISA法和FCXM法两种方法的优势，在保证样本高通量检测的同时，所需的血清样本体积和试剂用量的减少使得检测成本大大降低。与此同时，由于采用微球的表面积较ELISA 96孔板小，其非特异性结合也大幅降低[16]。因此，更为精准和高通量的Luminex法逐渐成为临床检测DSA的主流[17,18](表2)。
几种常见DSA检测方法的原理及优缺点
几种常见DSA检测方法的原理及优缺点
| 检测方法 | 原理 | 优缺点 |
|---|---|---|
| CDC | 抗体与细胞膜表面相应HLA抗原结合，形成抗原抗体复合物进而激活补体经典途径形成攻膜复合物，裂解淋巴细胞。 | 检测DSA金标准，能检测到非抗HLA抗体，而对非补体固定的抗HLA抗体无法检测，但特异性不强，结果易受抗淋巴细胞治疗的影响。 |
| AHG-CDC | 在CDC方法的基础上加入抗人免疫球蛋白，增强补体C1q的结合效率。 | 可检出非补体固定的抗HLA抗体，提高CDC法的敏感性，但特异性不强，结果易受抗淋巴细胞治疗的影响。 |
| ELISA | 结合在固相载体表面的HLA抗原与待检样本中的DSA抗体发生特异性结合反应，然后加入酶标记的二抗，最终通过酶与底物产生颜色反应，从而进行定量测定。 | 可测定补体结合和非补体结合的DSA抗体，且结果不受IgM的干扰，重复性好，但所需样本量大，结果有一定的偏差。 |
| FCXM | 待检受者血清样本与供者淋巴细胞反应后加入荧光素标记的抗人免疫球蛋白二抗，最终行流式细胞术进行参数分析。 | 增强了检测低水平HLA抗体的能力，但特异性不强，结果易受抗淋巴细胞治疗的影响。 |
| Luminex-SA | 微球包被重组HLA抗原，与受者血清中的DSA发生反应后，加入PE偶联的抗人IgG二抗孵育，上机，检测分析。 | 无需供者淋巴细胞，所需的血清样本体积和试剂用量的减少，高通量，成本低，特异性高，灵敏度高。 |
| Luminex Xm-DSA | 微球包被抗HLA抗体，在加入供者淋巴细胞裂解液后，加入受者血清，最后加入PE偶联的抗人IgG二抗孵育，上机，检测分析。 | 所需的血清样本体积和试剂用量的减少，高通量，但需要供者淋巴细胞的参与，特异性低，灵敏度较低，成本高。 |
注：CDC为补体依赖性细胞毒试验，AHG-CDC为抗人球蛋白-CDC，FCXM为流式细胞仪交叉配型，ELISA为酶联免疫吸附试验，SA为供者特异性抗体单一抗原检测，Xm-DSA为供者特异性抗体交叉配型
19世纪60年代末，Terasaki等[19]创造性的提出DSA可迅速破坏移植物，并将移植前CDC法引入肾移植。1975年，Pierce等[20]明确报道供者特异性抗体与肾移植慢性排斥密切相关，他们采用AHG-CDC的方法检测DSA，发现移植后5～43个月移植物功能丧失的13例患者中，11例患者的血清中均有DSA的存在。2006年，Eric MG等首次采用Luminex方法检测经AHG-CDC法确定PRA为阴性的肾移植患者血清中的PRA和DSA，结果发现PRA Ⅰ类和Ⅱ类均高于15%。与此同时，对PRA高于30%的血清再进行DSA的检测，发现DSA阳性的患者中，其移植肾功能延迟恢复、急性排斥反应的发生率显著增加；移植物6个月存活率显著降低。相反如果血清中含有抗体而并非DSA，患者的预后比DSA组要好[7]。由此可见，Luminex可对血清中低浓度的PRA和DSA进行检测，敏感度更高，扩大了检测范围，为更好的评估肾移植后风险发挥重要作用。Lefaucheur等[21]采用Luminex单一抗原法对402例连续肾移植患者移植前后血清中DSA的水平进行检测，发现移植前血清中有DSA的患者较移植前血清中不含DSA的患者，其8年移植物存活率明显降低，提示在条件允许的情况下，可对肾移植前受者血清DSA进行检测，以最大程度的降低肾移植的风险。Klein等[22]采用抗CD20抗体联合血浆置换和免疫吸附等方法对23例DSA阳性患者进行脱敏治疗，结果发现脱敏后的活体供肾移植受者肾移植物存活率大大增加，且无明显不良反应。Tang等[23]于2012年开展采用Luminex SA法检测亲属肾移植前后供者特异性抗体的水平。结果发现，24.6%的肾移植受者移植后产生DSA，且DSA阳性组肾移植后12和24个月的肌酐水平明显高于DSA阴性组，发生急性排斥反应的风险也大大增加。因此，实时监测肾移植前后DSA的水平，可用于早期预测患者发生排斥反应的风险，提高肾移植物的存活率。
DSA是预测受者肾移植后发生抗体介导的排斥反应(antibody mediated rejection，AMR)和移植肾功能丧失的重要指标，采用Luminex技术检测术前患者体内DSA的水平可降低发生术后AMR的风险。但美国和荷兰的研究团队等均报道，体内存在DSA的患者也可成功接受肾移植，且术后并未发现AMR[24,25]。因此有必要对DSA进行更一步的细化检测，从而增加高致敏患者接受肾移植的机会。
补体系统具有参与排斥反应的功能，C1q、C3b、C3d、C4d、C5a等均在肾移植排斥反应中发挥重要作用[26,27]。DSA与相应抗原结合后形成的抗原抗体复合物，可进一步激活补体从而导致移植肾发生排斥反应，但并不是所有的抗体均能结合补体。赵杰等[28]采用Luminex-SA法检测30例高致敏患者术前补体C1q结合的DSA水平发现，与单纯使用DSA相比，C1q＋DSA预测术后发生AMR的特异性(90%)和阳性预测值(83.3%)均得到显著提升；Calp-Inal等[29]则在689例肾移植受者中采用Luminex-SA法检测C1q＋DSA，结果发现C1q＋DSA水平与肾移植受者急性AMR、慢性AMR的发生率呈正相关。Sicard等[30]同样采用Luminex-SA法，在69例已发生AMR的肾移植受者中检测C3d＋DSA和C4d＋DSA的水平，结果发现，与C4d＋DSA相比，C3d＋DSA发生移植肾功能丧失的风险更高。
因此，术前和术后对补体结合的DSA进行实时监测，有助于增加高致敏患者接受肾移植的机会，降低患者发生急性和慢性排斥反应的风险。
Luminex的发展经历了MAGPIX®，Luminex® 100/200™，和FLEXMAP 3D™三个阶段，每个阶段都展现出Luminex强大的应用前景，特别是近年来新推出的FLEXMAP 3D™技术[31,32]，1个反应管内可允许同时检测500个样本，并增加了更为先进的高速数字信号系统和强大的计算功能。不过Luminex也有它自身固有的缺陷。由于该检测基于蛋白质相互作用的原理，检测的不同分子之间不可避免的可能会存在交叉反应，因此应充分研究免疫系统，根据抗原抗体之间反应的特点，有效避免非特异性结合的发生[33]。与此同时，由于该方法敏感度高，会造成一定程度的强背景，因此在实验中务必做好阳性和阴性对照，避免假阳性的产生。我们相信，Luminex技术方法的改进会使DSA检测变得更加高效、迅速，大大降低患者的就医成本，从而更好的满足临床对DSA检测高通量的需求。随着生物医学技术的不断改进，Luminex技术将会更加广泛地应用到临床医学的各个领域。
