利用CRISPR/Cas9技术构建Crx-iCreERT2红色荧光报告人胚胎干细胞(ESCs)系及其3D视网膜类器官培养。
对H9细胞系靶位点序列进行PCR扩增并测序验证后，利用CRISPR/Cas9技术设计多条sgRNA并对其进行活性检测，根据活性、特异性等因素选择最合适的sgRNA。经酶切鉴定和测序确认打靶载体构建完成后，将打靶载体电转H9细胞系，在hES-ZLM-001基因Exon4和3’-非翻译区之间终止密码子前插入P2A-tdTomato-P2A-iCreERT2，进行药物筛选、阳性克隆富集。设计引物对目标区域进行PCR扩增并测序，根据测序结果和测序峰图选出纯合去抗性敲进阳性细胞克隆。培养所得1-A07细胞系，通过流式细胞分析法检测OCT4阳性细胞比例，采用细胞爬片免疫荧光染色法观察干细胞标志物SOX2、NANOG和SSEA4表达情况。采用核型分析方法检测细胞核型。应用3D培养技术获得视网膜类器官，于分化后不同时间点行冰冻切片，免疫荧光染色法检测不同种类细胞分子标志物的表达分布情况。
H9细胞系靶位点序列与Genebank和Ensembl所提供序列一致。根据H9细胞系靶位点序列共设计16条sgRNA，最终选择sgRNA8和sgRNA12作为sgRNA。电转后通过PCR筛选得到4个去抗性敲进阳性克隆，其中1-A07细胞系经流式细胞仪分析OCT4阳性细胞比例约为98.7%，所得细胞系外源性tdTomato-P2A-iCreERT2片段重组位置正确，正常表达干细胞标志物，核型分析结果正常。应用3D培养技术可定向诱导1-A07细胞系分化为表达tdTomato红色荧光的视网膜类器官。分化后30 d，出现BRN3A阳性神经节细胞、CALBINDIN阳性水平细胞、CHAT阳性无长突细胞，分化后45 d，出现RECOVERIN阳性光感受器细胞，分化后90 d出现PKCα阳性双极细胞。神经节细胞分布于视网膜类器官深层，水平细胞、无长突细胞、双极细胞分布于中深层，光感受器细胞主要分布于顶层。
成功构建Crx-iCreERT2红色荧光报告人ESCs系，该细胞系可经3D培养诱导分化为表达tdTomato红色荧光的视网膜类器官。得到的视网膜类器官同人类正常视网膜的神经细胞组成一致，且发育的时间和空间顺序接近于正常的人类视网膜。该细胞系是一种强大的工具，可帮助实现人类视网膜发育和疾病产生的相关研究，并促进致盲疾病治疗方法的开发。
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视网膜退行性疾病包括视网膜色素变性、Leber先天性黑矇、年龄相关性黄斑变性等，均伴随光感受器功能障碍和丧失，最终导致视力障碍和盲。在疾病早期阶段，视网膜内尚有相当数量的光感受器细胞存在，将其作为靶细胞进行基因治疗和基因编辑是非常有前景的治疗方法。在光感受器细胞已大量丧失的疾病晚期阶段，以恢复视网膜光敏性为目的的替代策略正处于探索阶段，包括光遗传工具、光敏开关、视网膜假体和光感受器移植，其中光感受器移植是一种很有前途的再生策略，影响其治疗效果的一个重要因素为供体细胞的来源。视网膜变性疾病的细胞治疗中首选活性强、有丝分裂后的原代光感受器细胞，即光感受器前体细胞。移植后光感受器前体细胞较成熟的光感受器细胞有更高的存活率，在视网膜下间隙可有效成熟，对晚期视网膜变性的功能修复有一定效果。以往研究利用2D培养系统从胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)和诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)中获得可移植的光感受器，但其效率低，仅有不足20%的细胞表达光感受器特异性标志物。3D培养是指在体外培养时为细胞提供一个接近体内微环境的培养技术。近年来其在体外生物科学领域迅速发展，实现了体外类器官的培养。2011年，Eiraku等在体外培养光感受器方面取得了重大突破，首次通过3D培养技术将小鼠ESCs诱导分化为视杯。目前已有许多从人ESCs和iPSCs产生神经视网膜类器官的3D培养方案。随着培养技术的进步，理论上可以实现从ESCs及iPSCs产生无限数量的可移植光感受器，光感受器移植用于临床的基本前提已经确立。然而筛选出合适的光感受器前体细胞尚需抗原-抗体反应步骤，影响了细胞活性，且带抗体的细胞可能对移植效果有影响。成簇规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)/CRISPR关联(CRISPR associated，Cas)基因是一种原核生物的免疫系统，其可准确识别外源DNA，利用Cas蛋白将DNA双链切断，因此成为第3代基因组定点编辑技术。利用CRISPR/Cas技术对细胞系进行基因编辑可实现所需细胞系的构建。Crx是一种同源结构域转录因子，为光感受器前体细胞的分子标志物，可用于筛选适合移植的光感受器前体细胞。TdTomato是一种信号非常强的红色荧光蛋白，对细胞和小鼠无明显毒性，是理想的细胞成像工具。本研究中拟通过CRISPR/Cas技术构建Crx-iCreERT2荧光报告人ESCs系，其3D培养得到的视网膜类器官中表达的tdTomato荧光可指示光感受器前体细胞，为光感受器移植疗法提供供体来源及细胞筛选、为人类视网膜发育和疾病发生的相关研究提供支持。
