探究启动子结合蛋白(C/EBPα)对于间充质干细胞(MSC)C3H10T1/2细胞成骨调节的分子机制。
体外构建成骨分化模型，应用反向聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹检测C3H10T1/2细胞成骨分化时过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)的mRNA和蛋白质的表达；通过构建干扰PPARγ siRNA的腺病毒载体及PPARγ拮抗剂G3335，观察PPARγ对于激活C/EBPα表达的作用。色质免疫沉淀分析(ChIP)检测PPARγ2位于C/EBPα启动子－1 286 bp/－1 065 bp区域内的结合位点并检测PPARγ与C/EBPα启动子－1 286 bp/－1 065 bp区段DNA甲基化和组蛋白高度去乙酰化的关系。
C3H10T1/2细胞在成骨分化时，PPARγ的mRNA和蛋白质的表达呈先升高后下降的双时相反应。siRNA和G3335引起的PPARγ活性的下调抑制了C/EBPα在C3H10T1/2细胞成骨分化时的上调(对照组6.1 mg/L，罗格列酮组13.0 mg/L，罗格列酮＋G3335组11.0 mg/L, P<0.05)。DNA甲基化能减弱PPARγ2向－1 286 bp/－1 065 bp区段的结合能力。
C3H10T1/2细胞在成骨分化时，PPARγ通过结合至C/EBPα启动子－1 286 bp/－1 065 bp区段来促进该基因的表达，阻抑了PPARγ与之结合，与PPARγ相关的蛋白去乙酰化酶抑制得以解除，从而下调了－1 286 bp/－1 065 bp区段的组蛋白乙酰化，C/EBPα启动子促进C3H10T1/2细胞成骨过程。
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在多种类型的人类疾病中，间充质干细胞(MSC)的成骨与成脂肪作用之间的平衡会受到破坏。因此，可以通过调节骨形成与脂肪形成的平衡来预防、治疗体内不正常的骨形成与过度的脂肪形成[1]。基因启动子(CCAAT)结合蛋白(C/EBPα)作为一种脂肪形成的主要转录因子，具有调节C3H10T1/2型MSC成骨与成脂肪作用平衡的作用，通过表观遗传修饰(DNA甲基化与组蛋白乙酰化)来发挥重要作用[2]。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)可通过移除组蛋白脱乙酰基酶(HDAC1)来降解蛋白酶体，从而激活C/EBPα的表达[3]。PPARγ的结合位点(－1 240 bp/－1 223 bp)应该位于C/EBPα作用的－1 286 bp/－1 065 bp区段中。所以假设在成骨作用终末期，C/EBPα作用区域DNA甲基化阻抑了PPARγ的结合，HDAC1积累于－1 286 bp/－1 065 bp区段中，引起这个区段的组蛋白去乙酰化。为了验证这一假设，本研究观察C3H10T1/2细胞成骨时，PPARγ是如何激活C/EBPα表达以及DNA甲基化与组蛋白乙酰化调节C3H10T1/2细胞成骨作用的分子机制。
C3H10T1/2细胞保存于添加了10%胎牛血清、50 U/ml青霉素、50 g/L链霉素的DMEM培养基中(Invitrogen, Carlsbad，CA，美国)。培养基放置在37 ℃、5%CO2的人工环境下培养。C3H10T1/2细胞用终浓度为300 μg/L的rhBMP-2(R&D，Minneapolis，MN，美国)处理来进行成骨诱导分化。每3天更换1次培养基。
ALP的活性以p-硝基苯磷酸作为溶质，在405 nm波长下进行测定。将50 μl样品与50 μl p-硝基苯磷酸(1 g/L)在含有0.5 mmol/L MgCl2(pH 9.8)的1 mol/L二乙醇胺缓冲液中混合，在37 ℃环境下，置于摇床上混匀15 min。然后以每100 μl反应液加入25 μl的3 mol/L NaOH溶液来终止反应。使用PIERCE蛋白检测试剂盒(Rockford，IL，美国)，利用二奎磷酸法(BCA法)测定相同样本的总蛋白含量。在562 nm处读数并根据一系列的白蛋白(牛血清蛋白)标准进行计算。在实验中，ALP水平被标准化为总蛋白含量。每个实验在同一条件下均重复3次。
细胞RNA总量可根据试剂说明采用TRIzol分离液分离。在RNA逆转录反应后，根据ABI7900HT系统，采用SYBR®Premix Ex Taq™(Takara, Dalian，中国)进行RT-PCR的检测。RT-PCR按如下条件进行：94 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s为1个循环，进行40个循环。β-肌动蛋白作为成骨标记基因的内部对照。
配置加入蛋白裂解抑制剂(10 g/ml亮肽酶素，10 g/ml抑胃酶素A和10 g/ml抑肽酶)的RIPA缓冲液，将细胞与上述缓冲液于冰上裂解30 min。采用十二烷基酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)电泳分离技术将蛋白质分离并转移至硝化纤维薄膜上，并分别应用抗C/EBPα抗体(细胞信号转导技术)、抗PPARγ抗体(abcam)、抗肌动蛋白β抗体(Sigma)检测。使用增强化学发光系统(GE Healthcare Piscataway，NJ，美国)进行免疫染色。
5′端基因敲除突变体的构建用含有Xhol(5′)、Hind(3′)这两个酶切位点的pfu DNA聚合酶(Takara)从C3H10T1/2细胞DNA中，扩增C/EBPα基因5′调控区的1 426 bp片段(－1 381 bp/＋45 bp)。该片段被转入pGL3-Basic质粒(Promega，CharbonniErs，法国)中被复制，命名为－1 381 bp/＋45 bp片段。以－1 381 bp/＋45 bp为模板，借助PCR技术构建了若干5′截断突变体：－1 009 bp/＋45 bp，－420 bp/＋45 bp, －55 bp/＋45 bp。
包含CPG岛1的DNA片段均被限制性核酸内切酶切除，并经过凝胶电泳纯化后，使用CPG甲基化试剂盒(M.SssI每克DNA加入2 U，在37 ℃下孵育6 h)使得所有CPG岛位点甲基化。随后将M.SssI在65 ℃下保温15 min做失活处理。处理过的DNA片段与载体进行连接，之后用酚氯仿纯化并用乙醇沉淀。质粒的浓度通过A260来检测。
pcDNA3.1(＋)质粒中包含有特殊的Kpnl和Xbal位点，将编码鼠PPARγ2的序列插入其间。构建体的引物序列为：5′ATGGTACCATGGGTGAAACTCTGGGAGAT3′(＋)，5′CATTCTAGACTAATACAAGTCCTTGTAGAT3′(－)。显性负激活PPARγ2表达载体(PPARγ2-DN)是由pcDNA3.1(＋)-PPARγ经历了体外PPARγ编码区L496A位点的突变后构建而成。所有的功能质粒都经过了测序，且其各种过度表达的蛋白质也通过即时转染入人293T细胞和随后的免疫印迹分析得以验证。
细胞在37 ℃下与1%甲醛溶液混合10 min。之后用冷磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，放置于SDS裂解缓冲液中，超声处理至DNA片段大小为300～400 bp。再加入抗乙酰组蛋白3，4抗体(Upstate, New York, NY，美国)，抗HDAC1抗体和抗PPARγ抗体(abcam)。4 ℃过夜孵养后，用鱼精蛋白/DNA与50%琼脂糖混合浆(Santa Cruz, CA，美国)收集免疫复合物，约2 h，随后充分冲洗。得到的样品再用洗脱缓冲液(1%SDS，0.1 mol/L NaHCO3)抽提，加热至65 ℃过夜解除交联。DNA纯化并采用PCR技术检测。用于染色质免疫沉淀的引物组为：引物组A 5′GAGACGTGGGTGCTCACC3′(＋)；5′TTCTTTCCCTA-CTGTCATTCA3′(－)引物组B5′GAGACGTGGGTG-CTCACC3′(＋); 5′ATCGACTGTGCCGTAATCT3′(－)。
应用SPSS 10.0进行所有数据的分析，数据用M±s表示，用单因素方差分析(ANOVA)和Student T检验分析组间数据的统计学关系，P<0.05为差异有统计学意义。
将融合的C3H10T1/2细胞暴露于300 μg/L浓度的rhBMP2中建造体外成骨分化模型。BMP2治疗下，可观察到ALP活性显著升高。定量PCR的结果显示在BMP2处理后第14、21天，骨桥蛋白(OPN)和骨钙蛋白(OC)mRNA的表达水平以及成骨分化中期和末期的标记基因显著上调(图1)。PPARγ的mRNA含量水平呈双时相反应，即含量在第3～14天增加，在14 d达到最大水平，直到第21天才逐渐回落(图1)。
免疫印迹的结果显示了PPARγ蛋白质含量与mRNA含量具有同样的变化模式。PCR结果显示，siRNA和G3335引起的PPARγ活性的下调抑制了C/EBPα在C3H10T1/2细胞成骨分化时的上调。在C3H10T1/2细胞成骨分化时，PPARγ对于激活C/EBPα的活性的作用相同。2 h C/EBPα mRNA含量：对照组5.2 mg/L，罗格列酮组11.8 mg/L，罗格列酮＋G3335组10.1 mg/L；4 h C/EBPα mRNA含量：对照组6.1 mg/L，罗格列酮组12.4 mg/L，罗格列酮＋G335组10.8 mg/L；8 h C/EBPα mRNA含量：对照组6.1 mg/L，罗格列酮组13.0 mg/L，罗格列酮＋G3335组11.0 mg/L(图2)。
得到3个基因敲除片段，－1 009 bp/＋45 bp, －420 bp/＋45 bp, －55 bp/＋45 bp。不同的C/EBPα启动子片段分别被转入pGL3-Basic质粒(图3)。BMP2和罗格列酮处理后，－1 381 bp/＋45 bp区段的启动子活性显著升高，但－1 009 bp/＋45 bp区段的活性变化不明显。使C/EBPα启动子对BMP2和罗格列酮起效应的关键区域位于C/EBPα启动子的－1 381 bp/－1 009 bp区段内。
构建的过度表达的野生型PPARγ2基因(PPARγ2-WT)和显性负激活PPARγ2基因(PPARγ2- DN)的质粒载体，与－1 381 bp/＋45 bp，－1 009 bp/＋45 bp，－420 bp/＋45 bp, －55 bp/＋45 bp片段共转染至C3H10T1/2细胞内显示，PPARγ2-WT能显著提升－1 381 bp/＋45 bp片段启动子的活性，但对－1 009 bp/＋45 bp片段的启动子活性影响不明显。相比，PPARγ2-DN减弱了－1 381 bp/＋45 bp片段活性，而对－1 009 bp/＋45 bp片段活性影响不明显，在C/EBPα启动子－1 381 bp/－1 009 bp区域内可能存在PPARγ2的结合位点。
染色质免疫沉淀分析(ChIP)检测PPARγ2位于C/EBPα启动子－1 286 bp/－1 065 bp区域内的结合位点。在成骨分化终末期PPARγ2的结合力弱于分化早期。5′-aza可引起DNA去甲基化，从而恢复该区域PPARγ2的结合能力。在C3H10T1/2细胞成骨分化终末期，C/EBPα启动子－1 286 bp/－1 065 bp区域的DNA甲基化能阻断PPARγ2的结合。在体外将－1 286 bp/－1 065 bp区段甲基化，将载体转染至C3H10T1/2细胞内，并在经BMP2或罗格列酮处理后进行染色质免疫沉淀分析显示DNA甲基化能减弱PPARγ2向－1 286 bp/－1 065 bp区段的结合能力。
在C3H10T1/2细胞成骨分化的终末期(21 d)C/EBPα启动子－1 286 bp/－1 065 bp区段的组蛋白3、4发生去乙酰化。C/EBPα启动子区域的组蛋白3、4去乙酰化水平在一定程度上取决于DNA甲基化的水平。PPARγ可通过移除组蛋白脱乙酰基酶(HDAC1)来降解蛋白酶体，从而激活C/EBPα的表达。在C3H10T1/2细胞成骨分化早期(3 d)和终末期(21 d)时，同成骨分化早期相比，分化终末期的组蛋白3、4去乙酰化被阻抑，而HDAC1在C/EBPα启动子－1 286 bp/－1 065 bp区段的结合能力明显增强。5′-aza可将HDAC1从C/EBPα启动子－1 286 bp/－1 065 bp区段移除，引起此段组蛋白3、4高度去乙酰化。
在BMP2诱导3 d后，C/EBPα启动子－1 286 bp/－1 065 bp区段内，PPARγ2-WT和PPARγ2-DN的过度表达情况显示，HDAC结合能力和组蛋白3、4去乙酰化水平。PPARγ2-DN对于HDAC1结合能力的增强及组蛋白3、4去乙酰化的阻滞作用明显强于PPARγ2-WT。在BMP2和5′-aza诱导21 d后，可见类似的结果。
对间充质干细胞成骨分化的探究可帮助阐明MSC成骨分化的机制，也对治疗一些以骨质缺失为特点的疾病有重要作用。小鼠爬坡试验促进成骨分化中，PPARγ2和C/EBPα mRNAs的表达含量显著高于对照组[4]。C/EBPα能诱导C2C12成肌细胞分化成为成脂细胞和成骨细胞，并且成骨细胞的形成是在C/EBPα较低水平时而脂肪细胞特异性分化需要较高的C/EBPα表达[5]。Fan等[2]的研究进一步提供证据表明C/EBPα能够调节间充质干细胞成骨和成脂分化之间的平衡，其中涉及C/EBPα启动子－1 381 bp/－1 009 bp区域内显著的DNA甲基化和组蛋白3、4去乙酰化。本研究进一步验证了在C3H10T1/2细胞成骨分化时，PPARγ可通过结合C/EBPα启动子－1 286 bp/－1 065 bp区域来激活C/EBPα的表达，这意味着PPARγ可能成为另一个调节间充质干细胞成骨和成脂分化之间平衡的靶点。
本研究显示位于－1 286 bp/－1 065 bp的C/EBPα启动子区域内假定的PPARγ结合位点。因此推测在C3H10T1/2细胞成骨分化时，PPARγ对于C/EBPα具有激活作用。为了验证这一假设，我们首先构建了承载干扰PPARγ的siRNA的腺病毒载体并感染C3H10T1/2细胞，使得PPARγ表达下调。除此载体外，还使用了特异的PPARγ拮抗剂G3335来阻滞其活性，结果显示在C3H10T1/2细胞成骨分化时，PPARγ对于激活C/EBPα的活性至少起了一部分作用。本研究也观察到了PPARγ与结合于C/EBPα启动子－1 286 bp/－1 065 bp区段的HDAC1相拮抗，即PPARγ可将HDAC1从C/EBPα启动子－1 286 bp/－1 065 bp区段移除。
CpG区域甲基化、染色体结构和基因沉默是相互关联的。在体外，启动子序列的甲基化可抑制基因效应。CpG岛的甲基化能引起稳定的遗传转录沉默，其通过甲基-DNA特异蛋白结合于相应CpG岛来吸引组蛋白修饰酶，在局部形成一个染色质沉默状态。目前的研究结果表明，C/EBPα启动子－1 286 bp/－1 065 bp区域的DNA甲基化和组蛋白3、4的去乙酰化是由PPARγ相联系的，即－1 286 bp/－1 065 bp区域的DNA甲基化阻滞了PPARγ结合该区域，因此PPARγ相关的HDAC1抑制得到缓解，HDAC1可结合到－1 286 bp/－1 065 bp区域下调组蛋白的乙酰化水平。
如果运用原代间充质干细胞探寻MSCs在PPARγ、C/EBPα和表观遗传修饰等调节因素下的成骨分化的分子机制，取得的实验数据相对于细胞系来说无疑更接近体内的环境。但是有时候用原代细胞去研究表观遗传学会有相当的困难，因为原代细胞一旦脱离体内环境而在体外培养，遗传学状态往往会发生较大的变化。本实验构建的体外细胞模型为成骨分化模型，如构造更加系统的体外细胞模型，包括成骨、成脂肪共分化模型，可能获得关于动物表观遗传修饰的更多信息。
