探讨还原叶酸载体（RFC1）在结直肠癌（CRC）中的表达、相关信号通路及其与患者预后关系。
在癌症基因组图集（TCGA）数据库中分析RFC1基因在多种实体肿瘤及CRC中的表达情况。采用检索相互作用基因的搜索工具（STRING）建立RFC1蛋白相互作用网络。通过使用基因表达谱交互分析（GEPIA）数据库比较RFC1高、低表达组患者的生存期差异。使用注释、可视化和集成发现（DAVID）数据库对差异表达基因进行基因肿瘤学（GO）和京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析。分析CRC组织和癌旁正常组织中RFC1的免疫组化表达水平及其表达部位。
RFC1 mRNA在各种人类实体肿瘤中的表达差异并不明显。在CRC组织中，RFC1表达水平高于癌旁正常组织，但RFC1表达水平与患者的肿瘤分期无关。RFC1蛋白间的相互联系指数为119，平均蛋白间区域聚类系数为0.836，RFC1及其相互作用基因间存在明显的蛋白网络富集（P<0.05）。RFC1生物学过程主要富集于DNA复制、半保守复制维持端粒活性、DNA代谢过程、无差错翻译合成、参与DNA修复的DNA合成等；细胞成分主要富集于复制叉、染色体、核质、DNA复制因子C复合物、Ctf18类RFC复合物等；分子功能主要富集于DNA结合核酸结合、DNA结合受损、DNA活性、催化活性等。对于KEGG信号通路，RFC1主要富集于DNA复制、核苷酸切除修复、错配修复和恶性肿瘤发生等。RFC1高表达者的无病生存率和总生存率低于低表达组，其中两者在总生存率上的差异有统计学意义（P<0.05）。RFC1蛋白主要表达于细胞质，阳性表达呈现黄褐色颗粒状，均匀分布于细胞内，且在结直肠癌组织中RFC1大多为高或中表达，而在正常肠上皮中低表达。
RFC1在CRC组织中表达升高，其高表达与CRC患者的总生存率降低有关。RFC1可作为CRC预后不良的分子标志物，并可能成为CRC治疗的潜在靶点。
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结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是消化系统中常见的恶性肿瘤，也是重要的肿瘤致死原因[1]。近期的肿瘤流行病学数据显示，2020年全球范围内新发结肠癌1 148 515例，死亡576 858例，新发直肠癌732 210例，死亡339 022例，CRC病例数占所有恶性肿瘤病例的9.8%，而其致死人数占所有肿瘤死亡人数的9.2%[2]。CRC复发转移涉及多个基因、多个分子的生物学过程。相关研究结果也显示，环境和遗传因素在CRC的发生、发展有重要作用[3]。在遗传因素中，基因突变和表观遗传DNA甲基化变化可导致恶性肿瘤发生[4]。一碳代谢与DNA甲基化密切相关，其中叶酸、水溶性B族维生素在一碳代谢中发挥重要作用[5,6]。叶酸是人体必需的物质，可维持细胞增殖和组织再生[7]，叶酸缺乏可导致DNA低甲基化以及基因不稳定，从而诱发恶性肿瘤等相关疾病。研究表明，叶酸代谢功能障碍与多种疾病有关，如神经母细胞瘤[8]、乳腺癌[9]、非霍奇金淋巴瘤[10,11]和神经管缺陷[12]。叶酸的转运体包括叶酸受体（folate receptor，FR）、质子-偶联叶酸转运体（proton-coupled folate transporter，PCFT）与还原叶酸载体1（reduced folate carrier 1，RFC1）等，其在CRC等在恶性肿瘤的发生和发展中发挥了重要作用[13]。叶酸可通过受体（FR1）介导或载体介导机制运输到哺乳动物细胞中[14]。这两种机制之间的功能协调被认为是某些细胞类型中叶酸摄取的重要方法，RFC1在维持细胞内叶酸浓度方面发挥作用。已有研究结果证实，RFC1高表达与非小细胞肺癌的预后有关[14]。然而，关于RFC1表达水平与CRC关系及其相关信号通路鲜有报道。
在癌症基因组图集（the cancer genome atlas，TCGA）中，检索RFC1基因在人各系统实体肿瘤组织中的相对表达水平；在基因表达谱交互分析（gene expression profiling interactive analysis，GEPIA）数据库中比较CRC患者的CRC组织和癌旁正常肠上皮组织中RFC1 mRNA的相对表达水平，并分析其表达水平与患者肿瘤分期的关系。
使用检索相互作用基因的搜索工具（the search tool for the retrieval of interacting genes，STRING）数据库构建RFC1基因编码蛋白-蛋白相互作用网络（protein-protein interaction networks，PPI）。在网络构建的条件中，蛋白间的相互作用信度为0.4，相互作用蛋白数不高于21个，相互作用来源为共表达、基因功能和比邻关系。
使用注释、可视化和集成发现（the database for annotation, visualization and integrated discovery，DAVID）数据库对差异表达基因进行基因肿瘤学（gene ontology，GO）和京都基因和基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析。GO分析涉及生物学过程、细胞组分和分子功能。KEGG信号通路分析中将RFC1及相关PPI中的涉及的基因信号通路进行富集，富集条件为P<0.05，并计算基因数、背景基因及相关强度。
在GEPIA数据库中，依据RFC1 mRNA在CRC组织中的表达水平将CRC患者分为RFC1高表达组（>RFC1中位数）和低表达组（≤RFC1中位数）。依据比例风险回归模型（proportional hazards model，Cox）绘制高低表达组CRC患者的总生存和无病生存曲线，计算风险比（hazard ratio，HR）及置信区间。
使用数据库在线分析系统进行数据分析，同时应用R软件（https://www.r-project.org/）进行相关统计处理，RFC1 mRNA等计量资料采用均值±标准差（
±s）表示，组间比较采用F检验或t检验，生存分析采用Cox回归模型进行时序检验（Logrank）检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
在人不同类型实体肿瘤中，RFC1 mRNA的表达水平差异并不明显（图1）。在CRC组织中，RFC1表达水平高于肠上皮组织（图2）。但是，RFC1表达水平与患者的肿瘤分期的相关性无统计学意义（P>0.05）（图3）。
1—胶质瘤；2—甲状腺癌；3—肺癌；4—结直肠癌；5—头颈癌；6—胃癌；7—肝癌；8—胰腺癌；9—肾癌；10—尿路上皮癌；11—前列腺癌；12—睾丸癌；13—乳腺癌；14—宫颈癌；15—子宫内膜癌；16—卵巢癌；17—黑色素瘤；FPKM—每千个碱基的转录每百万映射读取的片段数
与癌旁正常组织比较，aP<0.05
从RFC1基因编码蛋白-蛋白相互作用网络中筛选出21个相关基因，蛋白间的相互联系指数为119，平均蛋白间区域聚类系数为0.836。该结果表明，RFC1及其相互作用基因间存在明显的网络富集（P<0.05）。（图4）
结果表明：RFC1生物学过程主要富集于DNA复制、通过半保守复制维持端粒活性、DNA代谢过程、无差错翻译合成、参与DNA修复的DNA合成等；细胞成分主要富集于复制叉、染色体、核质、DNA复制因子C复合物、Ctf18类RFC复合物等；分子功能主要富集于DNA结合核酸结合、DNA结合受损、DNA活性、催化活性等。（表1）
还原叶酸载体1（RFC1）基因生物学过程、细胞成分及分子功能富集分析结果
还原叶酸载体1（RFC1）基因生物学过程、细胞成分及分子功能富集分析结果
| 类别 | 功能 | 基因数 | 背景基因数 | 强度 | P值 |
|---|---|---|---|---|---|
| 生物学过程 | DNA复制 | 17 | 205 | 1.89 | 1.11×10-26 |
| 通过半保守复制维持端粒 | 12 | 25 | 2.65 | 2.61×10-25 | |
| DNA代谢过程 | 20 | 750 | 1.40 | 3.18×10-24 | |
| 端粒维持 | 13 | 112 | 2.03 | 5.49×10-21 | |
| 无差错翻译合成 | 10 | 22 | 2.63 | 1.58×10-20 | |
| DNA修复 | 17 | 522 | 1.48 | 1.64×10-20 | |
| 参与DNA修复的DNA合成 | 11 | 54 | 2.28 | 8.84×10-20 | |
| 细胞对DNA损伤刺激的反应 | 18 | 793 | 1.33 | 1.35×10-19 | |
| 易出错的易位合成 | 9 | 21 | 2.60 | 3.27×10-18 | |
| 细胞成分 | 复制叉 | 12 | 64 | 2.24 | 2.27×10-21 |
| 染色体 | 21 | 1 712 | 1.06 | 5.81×10-20 | |
| 核质 | 20 | 3 973 | 0.67 | 1.21×10-10 | |
| DNA复制因子C复合物 | 5 | 5 | 2.97 | 1.21×10-10 | |
| Ctf18类RFC复合物 | 5 | 7 | 2.82 | 1.62×10-10 | |
| 核复制叉 | 6 | 34 | 2.22 | 5.52×10-10 | |
| 答复 | 5 | 18 | 2.41 | 4.79×10-9 | |
| 蛋白质DNA复合物 | 7 | 195 | 1.52 | 1.40×10-7 | |
| 核 | 21 | 7 390 | 0.42 | 1.52×10-7 | |
| 核可复性 | 4 | 16 | 2.37 | 4.97×10-7 | |
| 分子功能 | DNA结合 | 19 | 2 470 | 0.86 | 4.70×10-12 |
| 核酸结合 | 20 | 3 947 | 0.67 | 3.56×10-10 | |
| DNA结合受损 | 6 | 64 | 1.94 | 9.39×10-8 | |
| DNA活性 | 3 | 3 | 2.97 | 1.14×10-5 | |
| 催化活性，作用于DNA | 5 | 184 | 1.40 | 5.8×10-4 | |
| DNA依赖性ATP酶活性 | 4 | 93 | 1.60 | 1.1×10-3 | |
| 单链DNA结合 | 4 | 113 | 1.52 | 2.1×10-3 | |
| ATP结合 | 9 | 1 464 | 0.76 | 2.6×10-3 | |
| 核苷酸结合 | 10 | 2 119 | 0.64 | 5.5×10-3 |
结果表明，RFC1及其相关基因信号通路主要富集于DNA复制、核苷酸切除修复、错配修复和恶性肿瘤发生等相关信号通路。（表2）
还原叶酸载体1（RFC1）及其相关基因京都基因和基因组百科全书富集分析结果
还原叶酸载体1（RFC1）及其相关基因京都基因和基因组百科全书富集分析结果
| KEGG通路 | 基因数 | 背景基因数 | 强度 | P值 |
|---|---|---|---|---|
| DNA复制 | 12 | 36 | 2.49 | 1.02×10-24 |
| 核苷酸切除修复 | 9 | 46 | 2.26 | 2.62×10-16 |
| 错配修复 | 8 | 23 | 2.51 | 3.31×10-16 |
| 恶性肿瘤发生途径 | 3 | 33 | 1.93 | 6.20×10-4 |
| 贫血途径 | 3 | 51 | 1.74 | 1.70×10-3 |
| 非同源末端连接 | 2 | 12 | 2.19 | 5.50×10-3 |
| 同源重组 | 2 | 39 | 1.68 | 4.20×10-2 |
结果表明，RFC1高表达组的无病生存率和总生存率均低于RFC1低表达组，且总生存率的差异有统计学意义（P=0.018）。（图5）
免疫组织化学染色显示，RFC1蛋白主要表达于细胞质，阳性表达呈现黄褐色颗粒状，均匀分布于细胞内。在结直肠癌组织中大多高或中表达，而在正常肠上皮中大多中或低表达，如图5所示。
大多数研究结果证实，CRC是由结直肠腺瘤逐步发展演化而来，但其进展为癌的分子机制并未完全明晰[15]。随着分子生物学和高通量测序技术的发展，更多的证据指向多基因集的时空表达失调在CRC发生和发展中发挥重要作用。高通量测序(如微阵列和RNA测序)的转录组分析被认为是癌症研究的重要工具，其可以识别候选预后和诊断生物标志物的相关基因和分子[16]。此外，这些生物标志物可能为改善CRC的预防和治疗带来突破性进展。近年来，对基因表达数据的生物信息学分析探索了CRC潜在的基因生物标志物，但生物信息学分析结果大多基于相关数据库，其结论并不完全一致[17,18]。
RFC1基因在人类定位于23号染色体，全长为45.57 Mb，其编码蛋白可介导还原叶酸并将环二核苷酸亚群导入转运体，对N5甲基四氢叶酸具有高度亲和力[13]，同时能够调节抗叶酸药物甲氨蝶呤的细胞内摄取。作为免疫反应性环状二核苷酸的导入分子，RFC1能够作为信号分子参与多种细胞代谢过程。在分子机制上，RFC1作为一种逆向转运蛋白，能够排出细胞内的有机阴离子，以促进其底物的摄取[19,20]。自首次克隆RFC分子以来，针对RFC的复杂转录和转录后调节，识别RFC分子中结构、功能重要的结构域和氨基酸等的研究取得了巨大进展。同时，已有多项研究结果证实了RFC1表达与肿瘤发生、发展及耐药的关系[21]。
本研究结果表明，CRC组织中的RFC1表达水平高于癌旁组织（正常肠上皮），提示RFC1可能在CRC的发生和发展中起到重要作用。RFC1的相关生物学功能集中于DNA复制、维持端粒活性、参与DNA修复的DNA合成等，提示RFC1可能主要参与了DNA复制及对复制过程中产生的错误进行校正。RFC1及其相关基因信号通路主要富集于DNA复制、核苷酸切除修复、错配修复和恶性肿瘤发生等相关信号通路。生存分析显示，RFC1高表达组的无病生存率和总生存率低于低表达组，其中二者在总生存率上的差异有统计学意义。
本研究中，对RFC1在CRC组织中的表达情况及相关信号通路和预后进行了生物信息学分析，证实RFC1主要与DNA合成及错配修复有关。同时证实，RFC1是CRC总生存较低的独立因素，RFC1可作为CRC预后不良相关分子标志物，并可能成为CRC的新治疗靶点。然而，本研究也存在一定的局限性，如本研究结果和结论主要基于TCGA、GEPIA等数据库的生物信息学分析，缺乏有效的本地临床数据或细胞试验的结果进行佐证。因此，后续应进行必要的临床和细胞学研究，进一步评价RFC1作为CRC患者预后不良相关分子标志物和潜在药物治疗靶点的可行性及临床价值。
所有作者均声明不存在利益冲突
