探讨肌肽对缺糖缺氧/复糖复氧（OGD/R）引起星形胶质细胞（astrocyte，AS）损伤的保护作用，并阐明其机制。
分离新生24 h SD大鼠大脑皮质，培养并纯化AS后，随机分为对照组、模型组、OGD/R+肌肽组（1、3、9 mmol/L）。倒置显微镜观察细胞形态；免疫荧光GFAP染色法测定细胞纯度；噻唑蓝（MTT）法检测细胞存活率；比色法检测乳酸脱氢酶（LDH）的漏出率；Hoechst 33258染色法检测细胞凋亡；流式细胞仪检测细胞内活性氧（ROS）含量；免疫荧光检测Phospho-Nrf2(S40)的入核水平；Western blotting法检测Nrf2总蛋白以及Phospho-Nrf2(S40）蛋白表达；qPCR法检测HO-1、NQO1 mRNA含量。
与对照组相比，模型组细胞活力明显降低（P<0.01），LDH漏出及细胞凋亡率显著增加（P< 0.01），细胞内ROS生成明显增加（P<0.01），AS核内Phospho-Nrf2(S40）含量及其下游产物HO-1、NQO1 mRNA表达量下调（P<0.01）。与模型组相比，OGD/R+肌肽组（1、3、9 mmol/L）细胞活力明显升高（P< 0.01），LDH漏出及细胞凋亡率降低（P<0.01），细胞内ROS生成不同程度减低（P<0.01），AS核内Phospho-Nrf2(S40）含量及其下游产物HO-1、NQO1 mRNA表达量上调（P<0.01）。
肌肽可通过抑制OGD/R诱导ROS释放，激活Nrf2-ARE通路，进而增强其下游抗氧化酶HO-1、NQO1 mRNA的表达，对AS发挥保护作用。
脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI）临床表现多样，病理过程复杂，氧化应激在其中发挥重要作用。星形胶质细胞（astrocyte，AS）不仅可以释放神经递质与神经活性肽，影响突触活性，维持突触稳定，对神经元具有支持和营养作用[1,2,3]，还在抗氧化防御中起到至关重要的作用，其功能障碍将会导致一系列神经系统变性疾病[4,5,6]。肌肽（carnosine，CAR）是由β-丙氨酸和L-组氨酸组成的二肽，存在骨骼肌、脑和心中，被认为是一种亲水性抗氧化剂，可抵御氧化损伤，对缺血损伤的神经细胞具有保护作用。前期研究表明肌肽对大鼠缺血再灌注引起的认知功能障碍具有保护作用[7]；肌肽还可抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）引起AS炎症因子白细胞介素1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）释放，其机制可能与肌肽抑制AS的活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成，进而抑制核转录因子кB p65（nuclear transcription factor-кB p65，NF-кB p65）激活有关[8]。在此研究基础上，通过建立缺糖缺氧/复糖复氧（oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）AS模型，探讨肌肽通过激活核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）/抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE）信号通路减轻AS氧糖剥夺损伤，为其临床应用提供理论基础和实验依据。
由锦州医科大学实验动物中心提供健康新生24 h内的Sprague-Dawley（SD）大鼠，不限雌雄，已通过实验动物伦理审查，编号：2020101501；实验动物使用许可证编号：SYXK（辽）2019-0007。
肌肽由苏州富士莱医药股份有限公司惠赠，批号：2104282，纯度≥99.9%；Advanced DMEM/F-12培养液购自GIBCO公司；DMEM/F12无糖基础培养液购自武汉普诺赛生命科技有限公司；新生牛血清（FBS）购自浙江天杭生物科技股份有限公司；活性氧ROS检测试剂盒、噻唑蓝（MTT）、乳酸脱氢酶毒性检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；RNA isolater裂解液、qPCR试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；GFAP抗体购自Biolegend公司；Nrf2抗体购自美国Cell Signaling公司；Phospho-Nrf2(S40）兔多克隆抗体购自上海爱必信生物科技有限公司；β-actin抗体购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；HRP辣根酶标记山羊抗兔IgG二抗、HRP辣根酶标记山羊抗鼠IgG二抗、FITC标记山羊抗兔IgG二抗、TRITC标记山羊抗兔IgG二抗购自EARTHOX公司。
生物安全柜（中国海尔生物医疗公司）；CO2培养箱、3气低氧培养箱（中国赛默飞世尔科技有限公司）；倒置生物显微镜（ZEISS公司）；荧光倒置显微镜、激光共聚焦显微镜（德国LEICA公司）；多功能酶标仪（美国BIOTEK公司）；流式细胞仪（美国BD公司）；实时荧光定量PCR仪（美国THERMO公司）。
取新生24 h内的SD大鼠双侧大脑皮质。将其剪成1 mm3大小，加入约2倍组织体积的胰酶细胞消化液，缓缓吹打混匀转移至15 mL离心管中，于37℃培养箱中消化10 min。加入与胰酶等体积的完全培养液终止消化。用200目滤网过滤组织液，800×g离心5 min，弃上清，再加入2 mL完全培养液，吹悬细胞。接种至25 cm2培养瓶中，补入3 mL完全培养液，置37 ℃、5% CO2培养箱培养。4 h后，收集上层未贴壁细胞悬液，加入新培养瓶中培养。第2 d换液1次，之后每3 d换液1次。细胞增殖至培养瓶底80%左右进行传代处理，传至第3代，进行后续试验。
用倒置显微镜观察细胞基本形态结构、贴壁情况及生长状态进行形态学鉴定。然后进行免疫荧光染色鉴定，步骤如下。待第3代细胞增殖至培养瓶底80%左右时，将细胞接种于预先包被有多聚赖氨酸的24孔板中，调整密度为1×104个/孔。细胞稳定贴壁后，室温下用4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次，5 min/次。冰上用通透液（含0.5% Triton X-100、2 mg/mL BSA的PBS）通透15 min。室温下用封闭液（含0.02% Triton-X-100、3% BSA的PBS）封闭30 min，加入GFAP一抗（1：100）冰盒4℃放置过夜。第2 d，吸除一抗，封闭液洗4次，5 min/次。加入TRITC标记山羊抗兔IgG二抗（1: 100），室温避光孵育2 h，封闭液洗3次，5 min/次。避光DAPI染核10 min，封闭液洗3次，5 min/次。免疫荧光显微镜下观察染色结果，AS细胞GFAP阳性，显红色荧光；DAPI染核，呈蓝色；随机选取不同视野的照片，分别计数GFAP阳性细胞数和DAPI阳性细胞数，其比例即为AS占所培养细胞的比例。
取第3代AS，待细胞增殖至培养瓶底80%左右时，移除完全培养基（含10%FBS+1%青霉素-链霉素溶液的DMEM/F-12），用基础培养基（含0.5% FBS+1%青霉素-链霉素溶液的DMEM/F-12）冲洗细胞3遍后，将细胞随机分为对照组（Con组）、模型组（OGD/R组）、OGD/R+ CAR组（1、3、9 mmol/L）。加入基础培养基培养12 h进行血清饥饿处理。血清饥饿结束前1 h，OGD/R+ CAR组（1、3、9 mmol/L）培养基加入相应终浓度的肌肽。血清饥饿结束后，OGD/R组、OGD/R+CAR组（1，3，9 mmol/L）分别更换含有0、1、3、9 mmol/L肌肽及1%青霉素-链霉素溶液的DMEM/F12无血清无糖培养液，放置于3气低氧培养箱（95% N2、5% CO2）37 ℃培养6 h，然后相对应更换为含有0、1、3、9 mmol/L肌肽的完全培养基常规培养24 h。
取第3代AS，以5×103个/孔的密度接种于96孔培养板内，按1.2.3中的实验分组给予相应处理。复氧结束后，避光弃上清，在每个孔中加入20 μL的MTT(5 mg/mL）溶液与80 μL无血清培养液混合液，置37 ℃、5% CO2培养箱培养4 h。弃上清，每个孔加入150 μL的DMSO，于多功能酶标仪上自动振板并检测490 nm的OD值。以不含细胞的孔调零，以对照组细胞的存活率为100%，细胞存活率%＝（实验组OD值-空白对照组OD值）/（对照组OD值-空白对照组OD值）×100%。实验重复3次，并设6个复孔，取平均值为最终结果。
取第3代AS，以5×103个/孔的密度接种于96孔培养板内，按1.2.3中的实验分组给予相应处理。复氧结束后，严格按乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒步骤操作，在490 nm处测定吸光度。计算测得的各组吸光度均相应减去背景空白对照孔吸光度，细胞毒性（%）＝（处理样品吸光度-样品对照孔吸光度）/（细胞最大酶活性的吸光度-样品对照孔吸光度）×100%。
取第3代AS，以1×104个/孔的密度接种于24孔培养板内，按1.2.3中的实验分组给予相应处理。复氧结束后，弃去原培养液，用PBS清洗3次，3 min/次。室温下用4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次，3 min/次。每孔加入500 μL 10 mg/L Hoechst33258染液，37 ℃避光染色30 min，PBS清洗3次，3 min/次，荧光显微镜下观察并拍照。
取第3代AS，以2×105个/孔的密度接种于6孔培养板内，按1.2.3中的实验分组给予相应处理。复氧结束后，弃去培养基，避光加入按1：1000用不含血清的DMEM/F-12培养液稀释的DCFH-DA探针，于37 ℃、5% CO2培养箱培养25 min。所有孔收集细胞至15 mL离心管，800×g离心3 min。避光弃上清，每管加入3 mL PBS重悬细胞，800×g再次离心3 min。避光弃上清，每管加入500 μL PBS重悬，并转移到流式管内使用流式细胞仪进行检测，488 nm激发波长，525 nm发射波长。
取第3代AS，以1×104个/孔的密度接种于24孔培养板内，按1.2.3中的实验分组给予相应处理。复氧结束后，室温下4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次，5 min/次。冰上用通透液通透15 min。室温下用封闭液封闭30 min，加入Phospho-Nrf2(S40)一抗（1: 100）冰盒4 ℃放置过夜。第2 d，吸除一抗，封闭液洗4次，5 min/次。加入FITC标记山羊抗兔IgG二抗（1: 100），室温避光孵育2 h，封闭液洗3次，5 min/次。避光DAPI染核10 min，封闭液洗3次，5 min/次。免疫荧光显微镜下观察染色结果。
取第3代AS，以1×106个/孔的密度接种于100 mm细胞培养皿内，按1.2.3中的实验分组给予相应处理。复氧结束后，取出培养皿，用细胞刮刀收集各组细胞，并于冰上裂解（裂解液按照RIPA：PMSF=100：1浓度配制）收样。BCA法对蛋白定量，常规Western blotting法检测Phospho-Nrf2(S40)、总Nrf2蛋白量，以β-actin作为内参照进行分析。
取第3代AS，按1.2.3中的实验分组，给予相应处理。复氧结束后，采用Trizol法提取各处理组细胞总RNA，并检测其浓度。严格按照反转录试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA，进行qPCR扩增。β-actin、血红素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）及醌氧化还原酶1（NAD(P)Hquinoneoxidoreductasel，NQO1）扩增引物购自博迈德生物基因技术有限公司。引物如下：β-actin上游CACTATCGGCAATGAGCGGTTCC，β-actin下游CAGCACTGTGTTGGCATAGAGGTC；HO-1上游GCCTCCTTGTACCATATCTATA，HO-1下游GTCATCTCCAGAGTGTTCAT；NQO1上游CG AATCTGACCTCTATGCTAT，NQO1下游GGCGAA TCCTGCTACAAG。反应结束后确认实时荧光定量PCR的扩增曲线和融解曲线，以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法计算HO-1及NQO1的mRNA相对表达量。
采用SPSS26.0软件对数据进行分析。计量资料以均数±标准差（
±s）表示，数据之间的比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），以P<0.01认为有显著差异。
胶质原纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）为AS骨架蛋白，常用于检测AS细胞纯度。在预实验对培养细胞进行1、2、4 h差速贴壁培养，结果发现4 h差速除掉杂细胞后培养细胞纯度效果最好，与文献中AS形态最为相符[9,10]，遂选择对4 h差速培养细胞进行鉴定。带有红色荧光的细胞为GFAP标记的AS，带有蓝色荧光的则为所有具有完整细胞核的细胞，两图经Merge处理，计算GFAP与DAPI共同标记的大鼠大脑皮质AS所占比例>99%，符合实验要求。后续实验均采用4 h差速培养细胞（图1）。
倒置相差显微镜下观察AS形态学特征，对照组细胞分布均匀，胞突丰富且较长，分枝多并相互交织成网，连接紧密，细胞形状不规则，光泽度较好。与对照组相比，模型组细胞形态出现异常，表现为胞体皱缩，脱落细胞增多，出现细胞碎片，光泽度降低；与模型组相比，OGD/R+CAR（1、3、9 mmol/L）组细胞形态均有不同程度改善，且肌肽浓度越高改善效果越明显（图2）。
A：对照组 B：模型组 C：OGD/R+CAR组（1 mmol/L） D：OGD/R+CAR组（3 mmol/L） E：OGD/R+CAR组（9 mmol/L）
A: Control group; B: OGD/R group；C: OGD/R +CAR group (1mmol/L)；D: OGD/R+ CAR group (3mmol/L); E: OGD/R+ CAR group (9mmol/L)
采用MTT法检测AS存活率，结果表明，与对照组相比，模型组细胞的存活率显著降低，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组相比，OGD/R+CAR（1、3、9 mmol/L）组细胞存活率升高，且肌肽浓度越高存活率升高越明显，差异均有统计学意义（P<0.01，图3）。
** P<0.01，与对照组比较 ##P<0.01，与模型组比较
**P<0.01 vs Control group; ##P<0.01 vs OGD/R group
采用比色法检测AS的LDH变化，与对照组相比，模型组LDH漏出率显著增高，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组相比，OGD/R+CAR（1、3、9 mmol/L）组细胞LDH漏出率减少，差异均有统计学意义（P< 0.01），且改善程度对肌肽浓度有一定的依赖性（图4）。
** P<0.01，与对照组比较 ##P<0.01，与模型组比较
**P<0.01 vs Control group; ##P<0.01 vs OGD/R group
Hoechst33258染色荧光显微镜下观察，正常细胞呈淡蓝色、染色质均匀的椭圆形，而凋亡细胞体积变小核固缩现象明显、荧光信号量度增强，呈浓密的亮蓝色。对照组、模型组凋亡率分别为（1.6±1.7）%、（53.0±4.8）%，与对照组相比，模型组凋亡率明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组相比，OGD/R+CAR(1、3、9 mmol/L）组细胞凋亡率有不同程度降低，分别为（36.3±2.7）%、（18.5±1.4）%、（4.0±2.5）%，差异均有统计学意义（P<0.01），且随着肌肽浓度增加凋亡率降低更为明显（图5）。
采用流式细胞仪DCFH-DA荧光探针法检测AS内ROS水平。与对照组相比，模型组ROS水平显著增加，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组相比，OGD/R+CAR(1、3、9 mmol/L）组ROS水平有不同程度降低，差异均有统计学意义（P<0.01），且随着肌肽浓度增加ROS水平降低更为明显（图6）。
A：对照组 B：模型组 C：OGD/R+CAR组（1 mmol/L） D：OGD/R+CAR组（3 mmol/L） E：OGD/R+CAR组（9 mmol/L） F：ROS水平统计量化图 ** P<0.01，与对照组比较 ##P<0.01，与模型组比较
A: Control group; B: OGD/R group；C: OGD/R +CAR group (1mmol/L)；D: OGD/R+ CAR group (3mmol/L); E:OGD/R+ CAR group (9mmol/L); F：Statistical quantification diagram of ROS level **P<0.01 vs Control group; ##P<0.01 vs OGD/R group
采用免疫荧光细胞化学染色法检测AS核内Phospho-Nrf2(S40）的表达，对照组、模型组的Phospho-Nrf2(S40）表达量分别为（22.4±2.5）%、（9.2±3.0）%，与对照组相比，模型组Phospho-Nrf2(S40）表达量降低。与模型组相比，OGD/R+CAR（1、3、9 mmol/L）组细胞Phospho-Nrf2(S40）表达量均增加，分别为（42.0± 2.2）%、（61.3±4.9）%、（80.4±2.8）%，且OGD/R+CAR(3、9 mmol/L）组Phospho-Nrf2(S40）表达增加更为明显（图7）。
Western blotting法检测蛋白表达水平，与对照组比较，模型组AS内Phospho-Nrf2(S40）蛋白表达水平明显减低，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组相比，OGD/R+CAR（1、3、9 mmol/L）组蛋白表达水平明显增高（P<0.01），且呈浓度依赖性，而各组总Nrf2表达量无显著变化（图8）。
A：Nrf2、Phospho-Nrf2(S40)、β-actin蛋白表达免疫印迹图 B：Phospho-Nrf2(S40)/Nrf2统计直方图 ** P<0.01，与对照组比较 ##P<0.01，与模型组比较
A: Western blotting diagram of Nrf2, Phospho-Nrf2(S40) and β-actin protein expression; B: statistical histogram of Phospho-Nrf2(S40)/Nrf2 **P<0.01 vs Control group; ##P<0.01 vs OGD/R group
采用qPCR法检测AS核内Nrf2下游产物HO-1、NQO1 mRNA的表达，与对照组相比，模型组HO-1、NQO1 mRNA的表达减少，差异有统计学意义（P< 0.01）；与模型组相比，OGD/R+CAR（1、3、9 mmol/L）组HO-1、NQO1 mRNA的表达增加，差异均有统计学意义（P<0.01），且呈浓度依赖性（图9）。
** P<0.01，与对照组比较 ##P<0.01，与模型组比较
**P<0.01 vs Control group; ##P<0.01 vs OGD/R group
AS是哺乳动物中枢神经系统含量最丰富的细胞类型，有很多突起，填充在神经细胞的胞体及其突起之间，对神经细胞起支持和分隔的作用，参与信号传递，调节突触可塑性及动作电位的传播，维持中枢神经系统微环境稳态[11,12,13,14,15]。对AS进行氧糖剥夺损伤处理，根据不同氧糖剥夺时间细胞存活率，最终选定氧糖剥夺6 h再恢复正常培养24 h进行实验，结果发现，与对照组相比，模型组AS的存活率下降、LDH释放量及凋亡增多，提示缺氧6 h、复氧24 h对AS造成一定程度损伤，该结果与文献报道一致[16]。在此基础上观察肌肽的药效，结果发现，与模型组相比，OGD/R+ CAR组AS存活率显著提高，细胞凋亡率及LDH释放量减少，且肌肽浓度越高改善效果越明显，表明肌肽对OGD/R引起的损伤具有保护作用。在实验中增加了单加肌肽组（9 mmol/L），与对照组相比，单加肌肽组细胞形态、存活率均无明显变化，说明肌肽对于正常AS影响不大。
ROS作为参与细胞生长、分化、进展和死亡的信号介质，过高能引起组织脂质过氧化，导致神经元细胞死亡、脑功能受损[17,18]。实验结果显示与对照组相比，模型组ROS生成显著增加，提示缺氧6 h、复氧24 h造成细胞氧化损伤；在此基础上施加肌肽预处理，相比于模型组，OGD/R+CAR组ROS生成受抑制，且随肌肽浓度增高抑制作用更显著，因此推测肌肽可能通过抑制ROS生成发挥抗氧化能力，保护细胞免受氧化应激诱导的细胞死亡[19,20]。
正常情况没有受到外界刺激时，Nrf2在胞浆与Keap1结合，被泛素化而降解；在适当的氧化刺激下，Nrf2发生磷酸化，与Keap1解离并移位到细胞核内，与ARE结合，调控下游抗氧化蛋白，启动ARE调控的下游基因HO-1、NQO1等的表达，增强细胞对氧化应激的抗性，提高机体抗氧化能力[21,22,23]。这条通路在维持细胞氧化还原平衡方面起关键作用[18]。结果发现，与对照组相比，模型组AS内Phospho-nrf2(S40）蛋白表达量下降，核转位趋势减弱，其下游产物HO-1、NQO1表达量也下调；而采用不同浓度肌肽预处理AS后再给予氧糖剥夺损伤，Phospho-nrf2(S40)及其下游产物HO-1、NQO1表达量均上调，AS内Phospho-nrf2(S40)的核转位也随浓度呈增加趋势。因此推测OGD/R损伤后，极过量的ROS蓄积对细胞造成严重的氧化损伤，导致其功能受损，不能有效激活Phospho-Nrf2(S40)；而肌肽预处理对于氧糖剥夺造成的损伤起到保护作用，肌肽预处理使ROS处于较为适宜水平，触发Keap1-Nrf2-ARE信号通路，从而诱导下游抗氧化酶基因HO-1、NQO1的表达，提高机体抗氧化能力。研究表明氧糖剥夺损伤模型构建时间不同，对Phospho-Nrf2(S40）的影响各异[24]，后续将对不同缺氧及复氧时间Keap1-Nrf2-ARE信号通路信号分子的变化趋势，以及肌肽对其影响进行进一步研究。
综上所述，肌肽预处理可有效降低氧糖剥夺造成的AS细胞损伤，其作用可能是肌肽通过发挥其抗氧化能力，激活Nrf2-ARE通路，进而增强其下游抗氧化酶HO-1、NQO1的表达，对AS产生保护作用。
